切向流过滤技术的原理和应用

【字体: 时间:2014年02月25日 来源:生物通

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  切向流过滤是一种浓缩和脱盐10ml到几千升样本溶液的有效方法。它可以用来从小的生物分子中分离大的生物分子,捕获细胞悬浮液以及澄清发酵液和细胞裂解物。TFF可以应用于一系列应用包括蛋白质化学,分子生物学,免疫学,生物化学和微生物学。本文将对切向流过滤技术的原理,主要参数和应用进行重点介绍。

TFF是切向流过滤,它是一种压力驱动的,根据分子尺寸的膜分离过程。用TFF,样本混合物不是像直流过滤那样被强迫通过一个单一的通路来通过膜。而是流体通过多次再循环的方式,切向通过膜的表面。这种由施加压力带来的“清扫”行为,降低了初始样本在膜表面的积累。比膜截留分子量大的目标分子得到了保留,然而小分子和缓冲液通过了膜。切向流过滤是一种浓缩和脱盐10ml到几千升样本溶液的有效方法。它可以用来从小的生物分子中分离大的生物分子,捕获细胞悬浮液以及澄清发酵液和细胞裂解物。TFF可以应用于一系列应用包括蛋白质化学,分子生物学,免疫学,生物化学和微生物学。本文将对切向流过滤技术的原理,主要参数和应用进行重点介绍。

常规过滤是指在压力的作用下,液体直接穿过滤膜进入下游,而大的颗粒或分子则被截留在膜的上游或内部,小的颗粒或分子透过膜进入下游。在这种操作方式下,液体的流动方向是垂直于膜表面进入下游的,所以也有人称之为“死端过滤”(Dead End Filtration)。常规过滤的应用包括澄清过滤、除菌过滤和除病毒过滤等等,不是本文讨论的重点。而切向流过滤则是指液体的流动方向是平行于膜表面的,在压力的作用下只有一部分的液体穿过滤膜进入下游,这种操作方式也有人称之为“错流过滤”(Cross Flow Filtration)。由于切向流在过滤过程中对膜包的表面进行不停的“冲刷”,所以在这种操作模式下有效的缓解了大的颗粒和分子在膜上的堆积,这就使得这种操作模式在很多应用中具有独特的优势。

切向流(也称为“错流”)过滤中,泵推动流体通过滤膜表面,冲刷去除其上截留的分子,从而使滤膜表面的积垢程度降至最低。于此同时,切向流体也会产生垂直于滤膜的压力,推动溶质和小分子通过滤膜。如此方能完成过滤。利用细分筛网分离沙子与鹅卵石的模拟试验,有助于理解切向流过滤的机理:筛网眼象征滤膜上的孔隙,而沙子与鹅卵石象征待分离的分子,在直流过滤中,沙子-鹅卵石混合物被迫向着筛网眼方向移动,随着一些较小的砂粒通过筛网眼落下,在筛网表面形成一个鹅卵石层,阻碍顶部砂粒向筛网方向移动并通过筛网眼(图1),在直流过滤中,增加压力,仅能对混合物施加压力,而无助于分离的促进;相比之下,在切向流过滤模式中,通过混合物的再循环防止限制层的形成,此再循环类似于:振动以去除阻塞筛网眼的鹅卵石,使得位于混合物顶部的砂粒落下并通过筛网眼。因此,利用切向流过滤进行生物分子分离,效率更高,浓缩或渗滤速度更为快捷。

图1 利用细分筛网分离沙子与鹅卵石


 
(A) 对混合物施加直接的压力,使得底部砂粒落下;在筛网表面形成一个鹅卵石层,阻碍顶部砂粒向筛网方向移动并通过筛网。
(B) 振动筛网,破坏位于混合物底部的积聚鹅卵石层,使完全分离得以进行;切向流过滤中,进料流的错流动力学作用,就相当于此例中的振动。

从滤膜的截留孔径进行分类,可以将过滤分为澄清过滤、微滤、超滤和反渗透等等。下图2 粗略的标明了不同级别的滤膜和过滤方式。  


 
相应的,将不同孔径的滤膜采用切向流的操作方式进行过滤,即可称之为切向流微滤、切向流超滤等等。

下图3 为经典切向流过滤系统的示意图和实物图,通常包括泵、膜包和夹具、贮罐、连接管件以及阀门和压力表等。

 

图3:经典切向流过滤系统示意图和实物图

在进行TFF操作的时候我们经常会遇到一些问题:比如目标蛋白回收率低,过滤一段时间之后进口端压力增高等等,如何有效的解决这些问题呢?我们必须要清楚切向流过滤的几个重要参数及他们之间的相互关系,确保通过实验条件的摸索和优化来确定适合样本的实验条件。这几个参数归纳起来就是2个压力参数和2个流速参数。


 
图4:主要参数介绍
(说明:PF = 进液压力,PR = 回流压力,Pp = 透过压力)

压差是进口端压力与出口端压力的差值,跨膜压(TMP)是指滤膜上下游的平均压力差(TMP = (PF + PR ) / 2-Pp),TFF实验我们关注的是压差,跨膜压,切向流速等,这几个参数是紧密联系在一起的,压差决定切向流速和切向流速率,当压差一定的情况下,切向流速和切向流速率是恒定的,跨膜压是控制液体过滤的速度的

所以我们要控制进口端压力和回流压力,这两个压力决定了TMP和压差,而当压差/切向流速恒定的情况下,TMP就成了切向流工艺中的关键因素,需要进行优化。

切向流是液体流速在膜表面冲刷的速度. 它是冲刷掉颗粒防止颗粒防止颗粒在膜表面的堆积。切向流带来的冲刷行为将颗粒从膜表面带走。进口端压力和切向流速(切向水通量或回流速),当你增加切向流速,你就同时增加了在进口端和回流端的压差∆p。如果你使切向流速加倍,你最终使∆p也得到加倍。部分关闭回流阀会增加TMP,最终推动液体通过膜, 回流阀关闭的越多,TMP越大,从而透过的液体增加的越多。对于大部分超滤应用来说,透过液阀门是开放的。

下面我们简单介绍几个关键的实验因素。

如何选择合适的切向流过滤系统,向Pall咨询>>


1 膜材质

经典超滤膜电镜照片:

对于超滤膜材质的选择一直困扰着广大科研工作者,尤其是刚接触TFF的研究者,选对正确的滤膜是进行切向流实验的基础。

目前市场上常见的滤膜选择如下:

滤膜

主要特性

超滤

 

Omega滤膜(改性聚醚砜树脂)

           非特异性蛋白质结合非常低

           DNA结合

           获得特别高的回收率

           卓越的物化性质

Alpha滤膜(改性聚醚砜树脂)

           耐受抗泡剂

           高流速及细胞外流体通路

微滤

 

Supor®滤膜(亲水性聚醚砜)

           低蛋白质结合

           高流速,高通量

超滤膜起过滤作用的是一层非常致密的皮层结构,一般小分子物质非常难进入滤膜,所以,超滤膜通常是污染物质堆积在滤膜表面,那么操作超滤时,需要控制流速来冲刷滤膜表面,优化压力来调节滤出速度。

到底什么样的膜才是一个理想的超滤膜,从电镜图中我们可以看到,膜皮层较薄,而支撑层内部孔径很大,从而保证快速的滤过,是高流速,高流量的基础。同时带来了弹性的可能,对于需要高流速的分子,可以提高流速,而对于不需要高流速的分子,可以适当降低流速。

支撑层孔径大,使工作压力可以适当降低,降低对活性分子的损伤,从而对于活性生物分子的纯化浓缩带来了便利。

从反复使用的清洁角度讲,支撑层孔径大,可以在适当的温度下进行彻底清洗,同时可以达到很好的清洗效果以及高的回收率,如果支撑层孔径小的话,清洗的温度需要升高,同时存在很高的清洗不净也就是污染的风险大大提高,此时回收率也得不到保证。

2 切向流速

切向流速很大程度上取决于所选用的不同膜包和流道的类型。在Pall的膜包操作和维护手册中,我们对每种膜包和不同流道类型都提供了推荐的切向流速。总的来说,在跨膜压不变的情况下,提高切向流量可以增加切向流对滤膜表面的“清洗”作用,缓解浓差极化,从而使透过液的流量提高。但是,过高的切向流量也会使产品所受到的剪切力增加,从而可能导致产品的活性下降。所以需要根据具体的应用来优化实验从而得到流速和产品回收两全的方法。

3 跨膜压

是不是跨膜压越高越好呢,理论来说,纯水过滤的话,跨膜压越高,过滤速度越快,但是实际上,处理料液过程,跨膜压会有一拐点,再提高滤速也不会加快。所以,我们需要在保证流体有冲刷力的前提下,提高跨膜压找到这一合适的点来进行实验,确保效率最高。

在恒定流量的切向流过滤实验中,通量与跨膜压之间的关系可以分为两个阶段(如图5)。最初时,影响通量的仅仅是滤膜的阻力,所以当跨膜压增加时通量会呈线性增加,称为压力相关区或膜控制区。随着跨膜压的不断增加,浓差极化现象加剧,部分增加的跨膜压被浓差极化层的阻力所抵消,因此通量的增加逐渐变缓。直至最后,所增加的跨膜压被浓差极化层的阻力完全抵消,此时,通量不再升高,称为压力不相关区或凝胶层控制区。

当选择的跨膜压处于凝胶层控制区时,通量可以达到最大化,所需的滤膜面积也可达到最小,但此时已经在滤膜表面形成了浓差极化层,此处的溶质浓度可能已经到达了其可溶解的极限,可能因此导致产品收率的下降。此外,浓差极化的后期可能导致堵塞,会引起通量不可逆转的下降。因此,优化的跨膜压值应该取在曲线的拐点处和之前。此时,滤膜还未被完全浓差极化,通量值也相对较高。


 
图5. 切向流实验中典型的滤过速度和跨膜压的关系

切向流过滤技术正在中国如火如荼,如何针对自己具体的实际应用来选择适合自己的切向流产品,是最为重要的第一步。选择好了合适的切向流过滤系统并进行合理的参数配置和优化可以使您今后的实验工作事半功倍。作为过滤行业的技术领导者,Pall公司多年来对切向流过滤技术从实验室规模到生产规模都进行了深入的研究,并针对中国开发了大量针对具体应用的实验方法,包括海水研究,病毒分子研究,蛋白/多糖类分子研究,抗体研究,中药研究,血液研究等,而且全球已经有海量文献发表。如果您有这方面的需求,不妨联系Pall公司试一下。

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