明星技术CRISPR操作指南(二)

【字体: 时间:2014年03月14日 来源:生物通

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  要在靶标DNA区域中挑选合适的碱基对,有几个方案可以选择,比如麻省理工学院的CRISPR Design(crispr.mit.edu);德国癌症研究中心开发的E-Crisp (www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr);还有ZiFiT targeter(zifit.partners.org/ ZiFiT/ ChoiceMenu.aspx)……

生物通报道:十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里,CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国,成为DNA突变和编辑的一种重要技术。

 

CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件:一个Cas酶,用于切断靶标DNA,比如目的基因中的DNA片段,另外一个就是称为导向RNAgRNA)的RNA分子,这种分子能通过互补结合靶标。gRNA也就是细菌细胞中CRISPR RNA的一个更短的版本,它能与Cas形成复合物,指导Cas到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件,或者改变Cas活性,来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

 

“目前,非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具,分析细胞中,和整个生物机体中突变的作用”,来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna表示,她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR的作用机制。近期,Doudna研究组利用这种工具,首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

 

不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异性:一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补。在这一方面,其它基因编辑方法,如锌指核酸酶(ZFN)和TALENS可能要比Cas-gRNA更为具有优势,因为这两者需要识别更长的靶标DNA序列。但是ZFNTALENS方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs难得多,而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENs,以及几十个不同的ZFNs,来证明其中一个有效。

 

第一步:明星技术CRISPR新手操作指南

 

要在靶标DNA区域中挑选合适的20个碱基对,有几个方案可以选择,比如麻省理工学院的CRISPR Designcrispr.mit.edu);德国癌症研究中心开发的E-Crisp www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr);还有ZiFiT targeterzifit.partners.org/ ZiFiT/ ChoiceMenu.aspx)。另外也可以筛选整个基因组,找到与你的靶标位点相似的其它位点。

 

其中只有CRISPR DesignE-Crisp可以预测哪些gRNA序列特异性最强,ZiFiT不具有这种功能。但是由于这些预测位点周边的不确定性,研究人员仍然无法确保gRNA的严格特异性,因此专家们通常建议检测至少3-5个不同的gRNA。这些序列可以通过例如Sigma Aldrich公司,或者Integrated DNA Technologies公司合成,每个费用大约为10-20美元(美国当地价格)。

 

虽然Cas9gRNA能通过各自的质粒来表达,但是研究人员也可以选择在同一个质粒中表达gRNACas9 ,这对于难转染的细胞来说比较合适,比如免疫细胞。Addgene公司也提供这种双表达质粒(价格为65美元,美国当地价格)。不过为了快速地测试不同的gRNAs,研究人员可以利用PCR构建编码gRNADNA片段,其中包含激活表达的启动子,然后将这个片段与携带Cas9的质粒一同转染细胞。这种方法无需克隆gRNA表达质粒,可以

节约两天时间,来自Broad研究院的张锋表示。

 

一旦你已经在细胞中表达了gRNACas9酶,那么这一复合物就能完成余下的工作,轻而易举地切断靶标DNA的两条链。尽管细胞的DNA修复机制会试图修补片段,但是由于存在一个称为非同源末端连接(nonhomologous end joining)的过程,因此往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸,造成移码突变,阻止基因表达。这样通过靶向基因起始位点的周围区域,研究人员就能阻断几乎所有的表达。

 

第二步:如何检测基因编辑的效率

 

虽然Cas9- gRNA复合物作用强大,但是我们可能仍然希望能直接检测下这一工具是否正确突变了靶标,或者有没有出现脱靶的现象。这种方法与ZFNTALEN不同——后两者通常需要检测许多融合蛋白,从中找到编辑靶标位点的那一个,CRISPR方法则往往是利用尝试的第一个gRNA突变靶标,正如来自麻省总医院的病理学家Keith Joung说的那样,他的实验室检测的约90%gRNAs都完成了目的靶标的突变。

 

然而,Cas9- gRNA在避免脱靶方面并不是那么可靠,去年发表的少数研究表明,一些gRNAs出现了多达五次错配的脱靶问题。不过还有一些研究表明gRNAs的特异性也很强,未曾出现过一次脱靶。Joung表示,虽然没有又快又好的方法来提高特异性,但我们可以挑选与潜在可能脱靶区域相似性最小的gRNAs,来进行这项研究,CRISPR Design等程序可以实现这一点。

 

Cas9- gRNA工具常用于失活许多细胞中的一个兴趣基因。研究人员可以通过证明这个基因产物无法表达,或者由于基因产物缺失而出现的某种细胞表型,来验证这个工具的作用。为了确保这些作用不是由于突变了脱靶位点造成的,我们可以利用一种Surveyor assay来直接分析DNA靶标位点,预测脱靶位点。这需要通过PCR,以及一种特殊的酶(只切割带有突变的PCR产物)放大靶标位点,然后再将突变和未突变的DNA片段在琼脂糖凝胶中分离开来,突变的片段会小一些,因为它们被切断过。

 

这种方法也可以用于构建具有所有兴趣基因相同突变的克隆细胞系,或者来自敲除小鼠的小鼠细胞,为了完成这些任务,我们可能需要确保Cas9- gRNA复合物没有在未预测位点上引入一个突变。对于这些实验我们可能还需要进行整个基因组的高通量测序。

 

未完待续……

(生物通:张迪)

 

 

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