明星技术CRISPR操作指南（二）

【字体：大中小】 时间：2014年03月14日 来源：生物通

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　　要在靶标DNA区域中挑选合适的碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的CRISPR Design（crispr.mit.edu）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp （www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiT targeter（zifit.partners.org/ ZiFiT/ ChoiceMenu.aspx）……

生物通报道：十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA突变和编辑的一种重要技术。

将CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA也就是细菌细胞中CRISPR RNA的一个更短的版本，它能与Cas形成复合物，指导Cas到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna表示，她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR的作用机制。近期，Doudna研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和TALENS可能要比Cas-gRNA更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标DNA序列。但是ZFN和TALENS方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENs，以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。

第一步：明星技术CRISPR新手操作指南

要在靶标DNA区域中挑选合适的20个碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的CRISPR Design（crispr.mit.edu）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp （www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiT targeter（zifit.partners.org/ ZiFiT/ ChoiceMenu.aspx）。另外也可以筛选整个基因组，找到与你的靶标位点相似的其它位点。

其中只有CRISPR Design和E-Crisp可以预测哪些gRNA序列特异性最强，ZiFiT不具有这种功能。但是由于这些预测位点周边的不确定性，研究人员仍然无法确保gRNA的严格特异性，因此专家们通常建议检测至少3-5个不同的gRNA。这些序列可以通过例如Sigma Aldrich公司，或者Integrated DNA Technologies公司合成，每个费用大约为10-20美元（美国当地价格）。

虽然Cas9和gRNA能通过各自的质粒来表达，但是研究人员也可以选择在同一个质粒中表达gRNA和Cas9 ，这对于难转染的细胞来说比较合适，比如免疫细胞。Addgene公司也提供这种双表达质粒（价格为65美元，美国当地价格）。不过为了快速地测试不同的gRNAs，研究人员可以利用PCR构建编码gRNA的DNA片段，其中包含激活表达的启动子，然后将这个片段与携带Cas9的质粒一同转染细胞。这种方法无需克隆gRNA表达质粒，可以

节约两天时间，来自Broad研究院的张锋表示。

一旦你已经在细胞中表达了gRNA和Cas9酶，那么这一复合物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶标DNA的两条链。尽管细胞的DNA修复机制会试图修补片段，但是由于存在一个称为非同源末端连接（nonhomologous end joining）的过程，因此往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。这样通过靶向基因起始位点的周围区域，研究人员就能阻断几乎所有的表达。

第二步：如何检测基因编辑的效率

虽然Cas9- gRNA复合物作用强大，但是我们可能仍然希望能直接检测下这一工具是否正确突变了靶标，或者有没有出现脱靶的现象。这种方法与ZFN、TALEN不同——后两者通常需要检测许多融合蛋白，从中找到编辑靶标位点的那一个，CRISPR方法则往往是利用尝试的第一个gRNA突变靶标，正如来自麻省总医院的病理学家Keith Joung说的那样，他的实验室检测的约90%的gRNAs都完成了目的靶标的突变。

然而，Cas9- gRNA在避免脱靶方面并不是那么可靠，去年发表的少数研究表明，一些gRNAs出现了多达五次错配的脱靶问题。不过还有一些研究表明gRNAs的特异性也很强，未曾出现过一次脱靶。Joung表示，虽然没有又快又好的方法来提高特异性，但我们可以挑选与潜在可能脱靶区域相似性最小的gRNAs，来进行这项研究，CRISPR Design等程序可以实现这一点。

Cas9- gRNA工具常用于失活许多细胞中的一个兴趣基因。研究人员可以通过证明这个基因产物无法表达，或者由于基因产物缺失而出现的某种细胞表型，来验证这个工具的作用。为了确保这些作用不是由于突变了脱靶位点造成的，我们可以利用一种Surveyor assay来直接分析DNA靶标位点，预测脱靶位点。这需要通过PCR，以及一种特殊的酶（只切割带有突变的PCR产物）放大靶标位点，然后再将突变和未突变的DNA片段在琼脂糖凝胶中分离开来，突变的片段会小一些，因为它们被切断过。