明星技术CRISPR操作指南（三）

生物通报道：十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类细胞中几乎每个基因单突变。

 

近期The Scientist杂志汇总了基因编辑过程中Cas和gRNA的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

 

第一步：明星技术CRISPR新手操作指南

第二步：明星技术CRISPR操作指南（二）

第三步：如何优化gRNA的特异性？

 

除了挑选与非靶标位点互补性最小的gRNA序列以外，还有两种可以减少脱靶效应的方法。

 

一个是转染的Cas9和gRNA表达质粒（或者gRNA PCR盒）数量尽可能的少，只要满足所必需的靶活性的最低量就行。因为这些浓度足以令靶标位点突变，就不会去突变非特异性位点，——脱靶活性通常比靶向活性要低。

 

另一种策略是采用Cas9的另外一种突变版本：Cas9 nickase，这种酶只会切割结合gRNA的那条DNA单链。正常的Cas9切割的是双链，单链缺口通常细胞会修补，但是如果细胞中表达的是Cas9 nickase，以及与同一DNA靶标结合的一对gRNAs，那么缺口上就能会出现突变。这种方法可以降低脱靶活性，因为不太可能两个gRNAs同时恰巧靠近脱靶位点。不过这种方法打靶效率可能会比正常Cas9和单个gRNA低。

 

要想消除所有的脱靶效应是不可能的，因为其中许多可能出现在基因组中的任何非编码区域。不过我们可以认为靶基因失活能引起可见的细胞效应，如果几个结合不同基因区域的gRNAs出现了相同的表型，那么就能假定具有不同的脱靶效应，Joung说。通过表达质粒将基因引入细胞，恢复失活基因的表型也是一种不错的验证方法。

 

第四步：利用Cas9-gRNA系统还能做什么

 

过去一年半的研究表明，Cas9-gRNA系统可以用于多个方面，比如张锋实验室就利用这一系统，在细胞中同时表达了，来自不同表达质粒的5个靶向不同基因的gRNAs，以及来自一个独立表达质粒的Cas9，切割所有靶标位点。“靶向超过5个基因也是可能的”，张锋说。而要想利用ZFN和TALENs系统做到这一点，是不可想象的，因为靶向单独一个位点都要花费大量的人力物力。

 

除了失活基因，利用Cas9-gRNA还可以纠正基因。来自佐治亚理工学院的生物医学工程叫声包钢（Gang Bao，音译）正在朝着这方面努力，他尝试纠正一个破坏性的单核苷酸突变，患有镰刀状细胞贫血症的患者其β-珠蛋白基因上的两个拷贝就出现了这种突变。研究人员利用Cas9 nickase和一对gRNA造成双缺口，同时将一个线性DNA片段转染进细胞中，片段大小通常为400-800碱基，也可以是能作为基因纠正模板的小质粒。

 

另外一个方面就是利用Cas9突变，这个突变并没有完全切割DNA，而是与能开启或关闭基因表达的蛋白结构域融合。gRNA可以指导这个修改后的Cas9到达正确的遗传元件，比如启动子和增强子，激活或抑制表达。这种用于基因抑制的方法被称为CRISPRi ，CRISPRi已被证明比RNAi（RNA干扰）更为有效。

（生物通：张迪）