活细胞RNA检测 一步轻松实现[新品推荐]

RT-PCR、FISH等虽然是检测RNA的经典方法，但颇为繁琐。其实，RNA的检测完全可以更smart。默克密理博最新推出的SmartFlare™ RNA“灵光”技术，只需一步孵育即可直接检测活细胞内特异的mRNA或miRNA，不仅简便，更可实现以往的方法所不能做到的突破性新实验设计。

一提到RNA的检测，大家的脑海中可能会立即浮现出：RT-PCR、FISH、Northern blot等。的确，这些都是检测RNA的经典方法，但它们需要裂解、固定、RNA抽提等，颇为繁琐。其实，RNA的检测完全可以更smart。默克密理博最新推出的SmartFlare™ RNA“灵光”技术，只需一步孵育即可直接检测活细胞内特异的mRNA或miRNA，不仅简便，更可实现以往的方法所不能做到的突破性新实验设计。

这种与众不同的SmartFlare RNA检测探针源自美国三院院士Chad Mirkin教授开发的NanoFlare技术。每个SmartFlare探针都是一个纳米金颗粒，上面连接着多拷贝的双链寡核苷酸序列：报告链和捕获链。报告链上带有荧光基团，在靠近纳米金颗粒时，荧光淬灭。当目标RNA与纳米金颗粒上的捕获链结合时，报告链被释放，上面的荧光基团会发出荧光，通过荧光检测平台检测到。

原理就是这么简单，实验操作更简单。在您的培养物中加入SmartFlare探针，孵育过夜，第二天检测，OK。无需细胞裂解，无需RNA抽提和扩增，也无需转染试剂。SmartFlare探针利用细胞自身的内吞机制进入活细胞，而且，在检测完成后，探针可以从细胞中排出，不影响下游检测。

如此smart的RNA检测技术，难怪一上市就备受瞩目。SmartFlare RNA“灵光”技术不仅被生物通读者评为2013年度生命科学十大创新产品，也斩获了两项国际创新科技奖：The Scientist Top 10 Innovations 2013和The Analytical Scientist Innovation Awards 2013。如今，这项技术已经应用在细胞分选、干细胞分化发育研究等多个方面，也有不少文章发表。

突破性胞内标志物活细胞分选

传统意义上的细胞分选是通过检测细胞表面蛋白标记物来实现的，这需要使用荧光标记的抗体。不过，如果蛋白标记物在胞浆内，则不能通过这种方法分选，因为抗体染色的过程需要固定、透化等步骤。有时候可通过转染入报告基因而达到分选细胞的目的，但是，这种方法可能会损害细胞的完整性，也可能扰乱细胞信号通路、干扰下游分析。之前由于只能局限于使用细胞表面标志物来分选细胞，大大限制了许多细胞分选的效率及纯度，比如肿瘤干细胞的分选。

现在利用SmartFlare检测试剂，我们能够根据基因表达水平，或结合表面蛋白标记物，完成细胞的分选，并进一步增殖活细胞群体。这种技术在检验胞内的标记物时不需要固定或透化细胞，也不需要转染试剂，让细胞在分选后仍然保持完整。更重要的是，这种颗粒是惰性的，对细胞无害，而且检测完成后SmartFlare颗粒会离开细胞，这意味着我们就能对分选出的细胞进行更多的生物功能研究。

这种根据RNA水平来检测和分离细胞的能力为我们探索细胞功能打开了一扇新的大门，也让我们能够对传统方法很难分选的细胞（如肿瘤干细胞）进行分选，并通过胞内标记物提高分选的准确性。

这一方面的应用成果已在著名期刊上发表。西北大学Feinberg医学院的研究人员总结了近期的黑色素瘤研究成果，认为Nodal信号通路的重新出现意义重大，它有望成为预后标志物和治疗靶点1。然而，Nodal是分泌蛋白，很难直接测定表达Nodal的黑色素瘤细胞的功能相关性。

他们认为，传统技术（如免疫组化、Western blot和RT-PCR）虽然能够测定Nodal的表达，但无法特异分选表达Nodal的亚群，用于进一步的功能研究。多亏有了特异针对Nodal mRNA的SmartFlare，黑色素瘤亚群的分选才得以轻松实现。这种方法最终鉴定出CD133在Nodal高表达的细胞中升高，有助于阐明Nodal在黑色素瘤发展中的作用。

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单细胞RNA数据，轻松实现异质细胞样品中特异亚群RNA鉴定

在体内，大部分细胞存在于异质组织中，细胞间的基因表达差异虽然很微小，但对组织功能很关键。那些测定基因表达平均值的技术（如RT-PCR）已不能满足某些研究人员的要求。或者你需要有非常大的样品量，先进行细胞分选得到细胞亚群，然后再通过RT-PCR才能得到此亚群细胞特异性的RNA检测，这是个非常繁琐又耗时耗样品的实验流程。而有了SmartFlare检测试剂，由于SmartFlare能得到基于单细胞的RNA数据，只需少量样品再配合流式细胞仪，我们就能轻松实现异质细胞样品中特异亚群RNA鉴定。

西北大学Feinberg医学院的另一个研究小组也在《Nature Immunology》上介绍了SmartFlare检测试剂的作用2。当细胞中存在DNA病毒时，身体会产生一类炎性体，而一种称为POP3的人体蛋白会干扰炎性体的产生。为了证明POP3在DNA病毒感染过程中的这种调节作用，文中应用了巨噬细胞特异表达POP3的转基因小鼠作为其重要的证明手段。 他们利用SmartFlare试剂及流式细胞平台，证实与野生型小鼠相比，POP3转基因小鼠的外周血和腹腔灌洗液的单核细胞及巨噬细胞中都过表达POP3，而其它细胞亚群中则没有POP3的表达。利用此转基因小鼠模型，他们实现了在活体中对这种蛋白作用的分析，并证明小鼠模型中的数据与在人体细胞中发现的数据类似，小鼠的 POP3蛋白也会削弱抗病毒反应和炎症。

活细胞miRNA及mRNA检测

microRNA（miRNA）作为一类小的非编码RNA，调控了多个细胞通路，影响免疫反应、肿瘤发展、器官发育等。miRNA的检测通常是利用传统的RNA检测方法开展的，如芯片、RT-PCR和RNA-seq，但这也面临着许多问题。miRNA很短，在RNA分离过程中可能会丢失，而扩增及引物设计不仅复杂，也有可能引入bias。而有了SmartFlare活细胞miRNA检测后，一切都变得大不同啦。

无需任何样品制备，只需一步过夜孵育，您就能轻松检测活细胞中的miRNA。不必担心miRNA会丢失，也不会在miRNA分离和样品制备过程中引入bias。SmartFlare检测试剂让您能够在单细胞水平研究miRNA，从而更好地了解整个细胞群体。并且，还能根据miRNA水平分选/富集活细胞，进一步揭示miRNA在信号网络中的作用。

SmartFlare技术对mRNA的活细胞检测也得到了科学家很好的应用，尤其是应用在干细胞分化过程中的活细胞连续观测中。慕尼黑工业大学的研究组在他们的干细胞报道中介绍了SmartFlare的这种新应用3,4。他们研究目标是心肌再生的方法，由于诱导及分化需要持续较长的一段培养时间，而鉴定一般都需要把细胞固定，无法继续连续的培养，并且鉴定的过程也很费时费力。他们一直希望有一种简便的鉴定活细胞标志物的方法，SmartFlare技术的出现，让他们很轻松地实现了这个愿望，SmartFlare被应用于体细胞重编程过程中Nanog及GDF3标志物的mRNA在活细胞中的表达，大大减轻了研究人员的工作量！

如此看来，活细胞的RNA检测果然很smart的。期待更多的科研者可以利用该技术在各自的研究中探索出新的应用，发表高分文章。

如何订购？默克密理博目前提供两种产品形式：目录探针和定制探针。目录探针是由专门的算法设计出的，其性能经过预先验证；而定制探针需要您利用同一算法自行设计，但未在细胞中检验过，当然，价格更高，货期更长。如果您有兴趣，可点击此处，了解他们有哪些目录探针。（生物通 余亮）

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参考文献：

1. Elisabeth S. et al. Melanoma Tumor Cell Heterogeneity: A Molecular Approach to Study Subpopulations Expressing the Embryonic Morphogen Nodal. Semin Oncol, http://dx.doi.org/10.1053/j.seminoncol.2014.02.001

2. Khare S. et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA viruses. Nat Immunol. 2014 15(4):343-53.

3. M.Derben et al. Establishment of induced pluripotent stem cells from pig adipose tissue-derived fibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2014; 62 - OP129

4. H. Lahm et al. Detection of pluripotency gene expression and validation of true iPS cell reprogramming by fluorescent reporter probes in live cells. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2014; 62 - SC183