ViewRNA技术在CTC细胞检测中的应用[创新技巧]

外周血循环肿瘤细胞（CTCs），是指进入人体外周血的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用与体外早期诊断，化疗药物的快速评估，肿瘤个体化治疗等领域。随着近些年肿瘤研究的深入，这一领域成为了研究的热点。但是因为CTCs细胞数量非常少，能否有效的分离和检测CTCs就成为了一项挑战。Affymetrix公司旗下的Panomics产品线提供了CTCs分离和检测的解决方案，并且应用这一技术的文献被发表在顶级杂志Nature上。

外周血循环肿瘤细胞（CTCs），通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。在癌症的转移、进化以及病人对药物的药效评估等研究中，CTCs在理解癌症转移的生物过程以及作为生物标志物评估癌症基因型等都扮演着重要的角色。但是，CTCs在转移性癌症病人的外周血中存在的数量极少，109个细胞大概才含有一个CTC（约1-100个CTCs/ml全血），所以必须选择一种较好的方法进行CTCs的分离，富集及鉴定。

对于CTCs的分离及鉴定，Affymetrix公司旗下的Panomics产品线提供了CTCs分离装置以及原位杂交ViewRNA相关产品。

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1. ScreenCell® filtration device循环肿瘤细胞分离装置

ScreenCell® filtration device是一种新颖的、可一次性利用肿瘤细胞大小对其进行分离的过滤装置[1]。此过滤装置利用膜原理对大个的循环肿瘤细胞进行截留，将非肿瘤细胞进行过滤除去，可快速、简单的将循环肿瘤细胞进行分离。而截留在膜上的CTCs可进行后续的培养、固定，及做其他后续相关鉴定试验。

2. QuantiGene ViewRNA CTCs原位检测平台

QuantiGene ViewRNA分析平台是一种新颖、具有单拷贝灵敏度、能应用于基因定位和定量的原位杂交检测方法。该平台可以应用于任何RNA的CTCs分析检测。它在应用于CTCs细胞检测时，可同时对4个以内的RNA进行检测（FISH）。该检测方法既可以应用于低通量的研究实验也可以应用于高通量筛选。

QuantiGene ViewRNA分析平台基于拥有**保护的探针组设计以及分支DNA（bDNA）信号放大技术。探针组包含20个探针对，可特异性地与目的基因杂交。信号放大过程基于两个相邻的探针与目的RNA之间特异性杂交。探针的这种两两相邻的设计有效地保证了检测的背景低、特异性好。同步放大且互相独立的信号放大系统使得该平台能够在一个细胞中同时对四个以内的目的RNA进行检测。检测分为四个主要步骤：样品准备，探针杂交，基于bDNA技术信号放大以及信号检测。图中为了描述清楚，每个基因只显示对应一对探针。

利用上述两种技术即可实现对CTCs的快速分离、基因RNA分子标志物的原位杂交鉴定。麻省总医院癌症中心Yu Min[2]等人利用此技术对CTCs进行RNA的原位杂交，鉴定出RNA分子Wnt 2在外周血循环肿瘤细胞中高表达，可作为治疗靶点，抑制肿瘤的转移。

该课题组建立了小鼠胰腺癌模型，并建立微流体分离装置将CTCs分离出来，而后利用单分子测序技术，发现9个肿瘤基因在CTCs中异常高表达。其中的一个基因，Wnt 2，在Oncomine database中被富集到与胰腺癌相关，所以引起了他们在胰腺癌模型中对肿瘤转移机制的极大兴趣。随后，该课题组利用Panomics-Quantigene ViewRNA技术，对CTCs中的细胞角蛋白和Wnt 2 的mRNA进行了双色染色RNA原位杂交，证实Wnt 2基因在64%表达角蛋白的细胞中都有较高的表达。之后他们又对Wnt 2的功能进行相关的过表达试验，同时又对人的CTCs细胞进行了相关的试验研究。*后得出结论：在人胰腺癌中，WNT通路对于癌症的转移起着非常重要的作用，同时可作为药物治疗的靶点阻止癌症的转移和发展。

[1] ISABELLE DESITTER, BELLA S. GUERROUAHEN et. al. A New Device for Rapid Isolation by Size and Characterization of Rare Circulating Tumor Cells [J]. ANTICANCER RESEARCH 31: 427-442 (2011)
[2] Min Yu, David T. Ting et.al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature.487(7408):510-513(2012).

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