挑战多肽合成极限--蛋白质化学合成

【字体: 时间:2014年04月08日 来源:基因有限公司

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  尽管1965年,中国科学家就能够喝成51个氨基酸的多肽胰岛素,但是这个合成整整花费了近6年的时间,而且汇集了当时全中国最优秀的有机合成专家。蛋白质的全合成在药物开发以及基础研究都具有重要的意义,尤其对于精确了解蛋白质的各种修饰,比如糖基化,磷酸化等,在生物过程中的作用机制。目前蛋白质化学合成主要有3种方法,液相片段缩合法,固相-液相结合法以及自然化学连接法。

在蛋白质中定点引入非天然氨基酸以及特定的标记修饰对于药物开发以及基础研究都具有非常重要的意义,目前只有化学合成方法能够在原子水平上把非天然氨基酸引入蛋白以及蛋白质特定位置的标记修饰,然而尽管化学合成多肽已经非常成熟,但是要合成长度超过100个氨基酸的蛋白质依然是一件极具挑战性的工作。目前蛋白质化学合成主要有以下几种方法:液相片段缩合法,固相-液相结合法以及自然化学连接方法(native chemical ligation,NCL)等三种方法。

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1, 液相片段缩合法

在1990年之前,已经能够合成超过100个氨基酸的蛋白,比如ribonuclease A (124 amino acids) [Yajima, H. &Fujii, N. 1981],lysozyme (129 amino acids) [Kenner, G. W. 1977],他们都是采用了液相片段缩合的方法,其利用全保护的肽段在液相进行连接,其原理图如下:


 
尽管采用该方法已经能够合成长度超过100个氨基酸的蛋白,但是片段缩合方法没有得到广泛的使用,主要原因:合成周期长,消旋问题,需要非常好的合成经验,保护肽段的溶解性非常差,中间体的分析鉴定无法完成等。

2, 固相-液相结合法

上世纪60年代,美国生物学家Merrifield开创了多肽合成的新时代,固相多肽合成方法(solid phase peptide synthesis, SPPS),因为无需进行中间体的分离纯化,合成快速,迅速取代了传统的液相合成,将一个多肽的合成时间从原来几个月的时间一下子缩减到只有几天时间,而且不再需要人员具有非常强的有机合成基础和相关知识经验,外加全自动多肽合成仪的上市,到上世纪80年代就基本取代了液相方法成为多肽合成的首选。美国PROTEIN TECHNOLOGY公司的科研人员利用全自动多肽合成仪TRIBUTE,采用了优化的方法(pseudoproline dipeptides)一次性合成了92个氨基酸的多肽。这一方法目前是合成长肽的常用的方法,因为它可以破坏合成过程中的多肽beta折叠结构的生成,beta折叠是导致固相多肽合成失败的一个重要原因。TRIBUTE全自动多肽合成仪是目前市面上一款适合进行长肽合成的全自动多肽合成仪,它最吸引人的地方在于其具有在线紫外监测以及自动反馈调节功能,能够在无需人为干涉的条件下,自动调整反应时间。此外,101个氨基酸的位置,涡流混合方式以及专利的红外在线加热功能都极大的丰富了这款设备的灵活性。


 
固相多肽合成(SPPS)原理图如下:


 
尽管固相多肽合成方法具有液相无法比拟的速度优势,但是固相方法合成长度一般不超过50个氨基酸,主要原因:每步反应无法彻底,导致杂质累积,另外溶剂,试剂中的杂质也会增加合成过程中的杂质。通过采用固相片段缩合方法能够合成超过100个氨基酸的的蛋白,比如将需要合成的多肽分为几个肽段,然后在固相中链接起来,或则在固相中合成所需要的片段,然后在液相中进行连接,但是无论是固相连接或液相连接,同样遇到溶解性以及消旋的问题,因此这种方法也没有得到非常广泛的使用。

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3, 自然化学连接方法

自上世纪90年代,自然化学连接方法被发明以来,受到了越来越多的关注,并成为目前合成蛋白的主要方法。自然化学连接方法利用游离的多肽,因为没有保护基团,所以没有溶解性的问题,同时采用目前成熟的固相多肽合成方法可以很方便的合成50个氨基酸的左右的多肽,2个以上的片段就能够得到100个氨基酸以上的蛋白,目前采用自然化学连接方法已经可以合成长度超过200个氨基酸的蛋白。其原理是利用C端为硫酯的肽段和N端半胱氨酸(Cys)在液相中经过一系列的中间体最后形成稳定的肽键,并将2个片段连接起来,其原理图如下:


 
由于自然化学连接方法需要使用到C端硫酯的肽段,目前合成C端硫酯的肽段主要用2种方法,一种是BOC方法,另外一种方法是FMOC方法,因为BOC方法直接合成无需采用特殊树脂,使用较为广泛,但是不太适合合成带修饰的肽段,比如糖肽,而且需要采用强酸HF进行切割,危险系数大,因此大多采用FMOC方法进行合成,虽然FMOC方法合成硫酯比较复杂,需要使用特殊树脂和特别处理步骤。目前国内也有很多人从事自然化学连接方法的研究,包括西安交通大学陆五元教授和清华大学刘磊教授等。

自然化学连接方法具有一定的局限性,比如必须要合成C端硫酯的肽段以及N端为半胱氨酸的肽段,这对部分不具备这样条件的蛋白合成是一种限制,虽然我们可以通过引入巯基的方法进行合成,然后脱硫,但是这样的合成路线,价格昂贵而且合成步骤繁琐。因此,非自然化学连接方法在蛋白质的合成中也有了很多报道,虽然部分非自然化学连接方法得到的是非肽键(non-peptide bond),但是在许多研究中这些非肽键部分不影响蛋白的结构,因此仍然也在一定范围内应用,比如:基于腙肟结构的连接(hydrazoneand oxime ligations),click-chemistry(Cu(I)-catalyzed azide-alkine [3+2] cycloaddition),Staudinger ligation,[Ru]-catalyzed ring-opening cross-metathesis等。

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