如何高效地捕获甲基化的DNA[新品推荐]

对于基因组水平的DNA甲基化研究，研究人员有很多选择，比如芯片或新一代测序，但是它们都有限制。表观遗传学研究人员需要的是一种能够选择性富集甲基化区域的工具，它必须全面，没有偏向性。罗氏NimbleGen的SeqCap Epi甲基化富集系统就是这样一种工具。

DNA甲基化在很多生物过程中扮演重要角色，这些过程包括胚胎发育、基因印记、X染色体失活以及染色体稳定性的维持。正常的DNA甲基化模式的改变与多种疾病相关，包括癌症、糖尿病和心血管疾病。因此，DNA甲基化已成为动植物研究中一个迅速增长的领域。

甲基化研究方法

对于基因组水平的DNA甲基化研究，研究人员有很多选择，比如芯片或新一代测序，但是它们都有限制。芯片缺乏发现新位点的灵活性，其基因组内容是固定的，不经常更新。芯片探针容易有批间差异，可能与非目标DNA交叉杂交，进一步干扰结果，故需要二次确认。而且，芯片不能带来单碱基的分辨率。

全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）的确能以单碱基分辨率报告整个基因组的DNA甲基化状态。不过，DNA的亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，使基因组大小加倍，因为处理和未处理的数据集都必须收集。这种处理也会损伤DNA，导致基因组信息的损失。这些都为数据分析带来了挑战。不过，作为一种鸟枪测序方法，WGBS颇为低效 – 约65%的read落在甲基化区域之外。因此，对于许多应用而言，这种技术成本过高。

一种解决方法是简化的亚硫酸氢盐测序（RRBS），利用甲基化依赖的限制性内切酶。通过富集包含CpG的基因组区域，RRBS降低了测序的要求和成本。不过RRBS也存在限制，因为测序覆盖度受到酶切位点分布的限制。常用的限制性内切酶MspI不可能识别基因组中所有的CpG区域。它有时会忽略一些重点区域。

显然，表观遗传学研究人员需要的是一种能够选择性富集甲基化区域的工具，它必须全面，没有偏向性。罗氏NimbleGen的SeqCap Epi甲基化富集系统就是这样一种工具。与罗氏的外显子组富集产品SeqCap EZ相同，SeqCap Epi使用数百万个寡核苷酸探针来捕获与疾病或表型相关的区域。与WGBS相比，覆盖度更深，通量更高，且成本更低，从而加速表观遗传学的探索。SeqCap Epi系统与其他常用的甲基化评估方法表现出良好的相关性，如WGBS和Illumina的Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。在此我们介绍一些使用的小技巧。

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探针设计

为了有效地识别和捕获甲基化的目标，探针必须靶定与任何感兴趣的区域相关的不同甲基化配置。实现这一点就需要数百万个寡核苷酸探针。对于SeqCap Epi富集系统，罗氏已预先设计了探针，靶定亚硫酸氢盐转化后的基因组模板的两条链，让研究人员能够从DNA的两个方向获得测序和甲基化数据。

对于人类和非人类物种，自定义设计也是可行的，大小达210 Mb。研究人员可直接与罗氏NimbleGen的设计者沟通，为他们感兴趣的特定区域设计探针。首先，研究人员将基因组目标的坐标发给罗氏NimbleGen。然后，设计者计算出可能的甲基化配置的捕获探针序列，并将新设计的分析发给客户确认。获得同意后，探针被制造出并发送给客户使用。

需要注意的是，NimbleGen的在线设计工具NimbleDesign目前仍不适用于SeqCap Epi系统的用户，但未来有可能会更新。

SNP检出

靶向的亚硫酸氢盐测序加速表观遗传探索的一种方法是正确识别感兴趣区域内的SNP。最常见的SNP是C-T的转换，这往往发生在CpG岛。在亚硫酸氢盐测序中，这种类型的多态性会被误认为是未甲基化的胞嘧啶，因为它们在测序数据中都显示为T。

然而，SeqCap Epi富集系统可以区分这两个事件，因为它靶定DNA的两条链。在这种情况下，由于另一条链的对应碱基也会被测序，C-T的多态性应当是显而易见的。

避免样品损失

靶向的亚硫酸氢盐测序需要更多的起始DNA，以补偿文库制备和富集过程中的损失和剧烈的亚硫酸氢盐处理所导致的损伤。不过研究人员可通过流程的小小变化，来减少这种损失。

SeqCap Epi系统的操作在富集前开展亚硫酸氢盐转化，这样分子复杂度得以更好地保存，让研究人员能够使用较少的样品，并体验到更高的重复性。传统的操作是在捕获后开展亚硫酸氢盐转化，一般需要3 μg样品。而在捕获前开展亚硫酸氢盐转化，样品起始量降至1 μg，且关键的测序指标有30%的改善，如均一性，这反映了文库复杂度的改善。

通过使用针对甲基化区域的富集产品，如罗氏的SeqCap Epi富集系统，研究人员能够靶定人类和非人类物种的特定区域。这将让人们更高效地探索差异甲基化的区域，并节省大量的时间和成本。（生物通编译）

本文作者David Guffey是罗氏应用科学部的技术服务顾问。

罗氏NimbleGen在今年推出SeqCap Epi甲基化富集系统，结合二代测序，可开展单碱基分辨率的样品甲基化分析。该产品系列包括：固定内容的、人类全基因组水平的甲基化位点的DNA片段富集方案；以及适合于各种不同应用的客户自选区域的目标序列富集产品。