怎样解决RNAi的脱靶问题

【字体: 时间:2014年07月16日 来源:生物通

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  RNAi是一种常用的基因失活工具,它的主要缺陷在于会引起序列特异性的脱靶效应。日前,Regensburg大学的Gunter Meister领导研究团队在Nucleic Acids Research杂志上发表文章,描述了一种能克服上述问题的新方法。这种被称为siPools的低成本方法,能够简单而精确的生成含有多达60种siRNA的混合物,将脱靶效应降低到检出限以下。

生物通报道:在使用杀伤性武器的时候,不伤及无辜很重要,对于RNA干涉(RNAi)来说也是如此。RNAi是一种常用的基因失活工具,它的主要缺陷在于会引起序列特异性的脱靶效应。这样的脱靶效应很难预测,因为siRNA能够影响与它部分互补的序列,像miRNA那样抑制基因的表达。

要减少脱靶效应,可以将针对同一mRNA的不同siRNA混合起来使用。这些siRNA作用于同一个目标,每种siRNA的浓度得以降低,稀释了各自的脱靶效应。然而,这一策略在实际操作中面临着两个问题。其一,目前“Smart pools”只包括四个合成的siRNA,复杂性还不足以显著减少脱靶效应,而合成更多siRNA的成本又太高。其二,利用DicerRNase III消化dsRNA时,siRNA混合物中会出现长度各异的剪切产物,进而引发许多问题。

日前,Regensburg大学的Gunter Meister领导研究团队在Nucleic Acids Research杂志上发表文章,描述了一种能克服上述问题的新方法。这种被称为siPools的低成本方法,能够简单而精确的生成含有多达60siRNA的混合物,将脱靶效应降低到检出限以下。

据介绍,siPools的关键一步是,设计针对同一个基因的几十种siRNA,并将这些序列结合到一个DNA模板上,不同siRNA序列之间以短序列相连。这些模板经过转录、退火和酶切就能生成成分明确的siRNA混合物。(延伸阅读:如何优化你的RNAi

为了验证siPools的效果,研究人员选择人类基因POLGSCYL1作为RNAi的靶标。之前有研究显示,针对这两个基因的siRNA很容易影响到MAD2基因的表达,因此它们可以作为检测脱靶效应的理想对象。

研究人员针对这两个基因,分别设计了含有60siRNAsiPools,然后用它们转染HeLa细胞。研究显示,在浓度相同的情况下,siPools敲低目标基因与单个siRNA一样有效。

这两个siPools都含有一个MAD2脱靶效应很强的siRNA。然而在转染之后,MAD2上并未发生可检测到的脱靶影响。研究人员随后又通过萤光素酶报告基因证实了这一点。

此外,研究人员还进行了全转录组的芯片分析。他们发现,单个脱靶siRNA除了MAD2以外还大大减少了许多其他的转录本,但siPoolsMAD2和总体转录本水平都没有影响。这说明,将大量siRNA混合起来的确能够大大降低RNAi的脱靶效应。下一步,Meister将进一步评估siPools在活体内作用效果。

值得注意的是,Meister等人还将siPools成功用于长非编码RNAlncRNA)。单个siRNA往往难以对lncRNA施加影响,这可能是因为单个siRNA难以接触到高度结构性的lncRNA分子。现在,研究团队正在构建针对lncRNAsiPool文库。

Meister及其同事已经成立了一家名为siTools的公司,专门生产和出售siPools产品。

 

生物通推荐原文:

siPools: highly complex but accurately defined siRNA pools eliminate off-target effects

Short interfering RNAs (siRNAs) are widely used as tool for gene inactivation in basic research and therapeutic applications. One of the major shortcomings of siRNA experiments are sequence-specific off-target effects. Such effects are largely unpredictable because siRNAs can affect partially complementary sequences and function like microRNAs (miRNAs), which inhibit gene expression on mRNA stability or translational levels. Here we demonstrate that novel, enzymatically generated siRNA pools—referred to as siPools—containing up to 60 accurately defined siRNAs eliminate off-target effects. This is achieved by the low concentration of each individual siRNA diluting sequence-specific off-target effects below detection limits. In fact, whole transcriptome analyses reveal that single siRNA transfections can severely affect global gene expression. However, when complex siRNA pools are transfected, almost no transcriptome alterations are observed. Taken together, we present enzymatically produced complex but accurately defined siRNA pools with potent on-target silencing but without detectable off-target effects.

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