RNA制备怎样才能万无一失

【字体: 时间:2014年07月29日 来源:生物通

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  众所周知,RNA是一种相当不稳定的分子,它在这一方面可比DNA差远了。我们大家在实验室里基本上都耳闻目睹过,处理这种核酸时发生的悲惨故事。幸运的是,随着RNA研究逐渐成为主流,可供选择的商业化工具也越来越丰富越来越成熟。

生物通报道:众所周知,RNA是一种相当不稳定的分子,它在这一方面可比DNA差远了。我们大家在实验室里基本上都耳闻目睹过,处理这种核酸时发生的悲惨故事。幸运的是,随着RNA研究逐渐成为主流,可供选择的商业化工具也越来越丰富越来越成熟。

RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意,又有哪些工具可以助我们一臂之力呢,且听下文分解。

RNA制备的四大祸害

碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此,RNA操作一般在0°C -4°C的中性或微酸性缓冲液中进行,人们也常常在其中添加螯合剂,比如0.1 mM EDTA。有些应用不允许EDTA的存在,这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。

在制备RNA时,RNase一直是个令人头疼的大问题,因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase,它们存在于细胞的小隔间里,当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外,实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是,我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂,也会沾到一些RNase,”Promega公司的产品经理Eric Vincent提醒道。

在收获组织或细胞时,“提取RNA要越快越好,或者就想办法令RNase失活,”NEB公司的RNA研究带头人Bret Robb指出。

如果不能立刻提取RNA,就应当通过速冻来稳定样本,或者将样本储存在特殊的RNA保存液中,比如AllProtect Tissue ReagentRNAlater。此外,PreAnalytiX公司的PAXgene Blood RNA Tube也很适合保存这样的样本,“不仅能确保RNA的安全,而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本,” Qiagen公司的Martin Schlumpberger介绍道。PreAnalytiX BDQIAGEN的一个合资公司。

绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液(例如Qiagen公司的RNAEasy),“可以失活任何样本所带的RNAse,”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY,那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA

据介绍,RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感,这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。(延伸阅读:乱花渐欲迷人眼,RNA-seq工具面面观

可不可以做到万无一失

如何才能保证RNA实验的成功,这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套,并且在专门的空间里进行,尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。


我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase,而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿,抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道,目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品(试剂盒、试剂和耗材),进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。

“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊,恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌,以免把RNase带到样本中去,”他解释道。而现在,你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂,从水、1M Tris5M NaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”

许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证,Mo Bio Laboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线,”培训操作者如何识别和消除污染源,Mo Bio公司的Carl Tsang介绍道。

我国大多数实验室还是使用玻璃器皿,这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时,才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后,研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测,比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。

添加剂的使用

DEPCDiethyl pyrocarbonate)一直被用于处理水和溶液,失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除,因为DEPC在高温下很不稳定,会释放出CO2然后消失,” Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道,Schlumpberger强调,如果没有正确处理,残余的DEPC也会使RNA失活。

对于那些不能高压灭菌的器物,我们可以用RNase Away试剂处理,然而将其浸泡在无RNAse的水里。

Vincent指出,RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例,RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse,包括RNAse ABC和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了,多加一层保险是很有必要的,”他说。

只要我们了解威胁RNA的主要因素(高pH、高温、金属离子和内切酶),就能够想办法一一化解。这时你会发现,RNA制备其实并没有那么难。

 

Josh P. Roberts撰写/叶予编译)

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