著名癌症中心如何使用数字PCR技术[创新技巧]

近年来，微滴式数字PCR（ddPCR）已经在癌症研究中发挥了举足轻重的作用。Bio-Rad的ddPCR技术能够定量微量的DNA和RNA目标，从而有助于稀有致癌突变的早期检测，以及其他应用，包括确定肿瘤亚型、优化药物治疗方案，和研究肿瘤演化。在西雅图著名的Fred Hutchinson癌症研究中心，科学家们从各个角度研究癌症及其他疾病的进程，以了解患病的影响因素，从而降低风险，挽救生命。在此，该中心的两名研究人员Muneesh Tewari 和Jason Bielas谈了他们如何利用QX100™微滴式数字PCR系统来突破核酸检测和定量的限制。

定量microRNA标志物

microRNA（miRNA）是小的调控RNA分子，具有不同的细胞功能。研究人员正将其作为癌症及其他疾病的生物标志物来积极研究。但不幸的是，利用传统技术，他们不能可靠测定血清或血浆中的这些分子。

数字PCR的概念已经存在了十多年，但由于成本高、通量有限、流程复杂，这项技术一直未被分子生物学或临床实验室广泛使用。如今，Fred Hutchinson癌症研究中心的Muneesh Tewari博士在利用实时定量PCR（qPCR）来测定血清和血浆中的miRNA，但他需要一种更可靠的方法，变化比qPCR更小。这时，ddPCR走进了他的视野。

“我们之所以选择Bio-Rad的QX100 ddPCR系统，是因为它是市场第一个从成本和通量上考虑，适合于实验室日常研究的数字PCR系统，”Tewari博士谈道。

在一项发表于《Nature Methods》的研究中，Tewari博士开展了qPCR与ddPCR的比较。他的团队分别在三个独立工作日中，对水和血浆中6种不同的合成miRNA连续稀释后的cDNA进行分析，结果发现与qPCR相比，ddPCR具有更高的精确度（变异系数低48-72%）。

这个团队随后比较了两种方法对血清中miRNA的检测，具体来说，是miR-141，一种晚期前列腺癌的生物标志物。他们收集了20名晚期前列腺癌患者和20名男性对照的血清样本，并利用qPCR和ddPCR进行分析。Tewari发现，ddPCR在每日重复性方面相对于qPCR有7倍的改善，并能够以更高的准确性区分病例和对照标本。

Tewari认为：“微滴式数字PCR让我们的工作更切合实际。ddPCR的精确性和重复性将为miRNA及其他核酸进一步开发成循环生物标志物铺平道路。”

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预测卵巢癌存活率

Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员也使用QX100 ddPCR系统来开发他们的QuanTILfy分析，它能够定量某些癌症类型中的肿瘤攻击性免疫细胞。肿瘤浸润T淋巴细胞（TIL）是一类特殊的肿瘤攻击性免疫细胞，已知能提高癌症存活率。TIL的增加是机体对癌症有免疫反应的一个标志。医生可通过TIL计数来预测生存结果，并确定哪些患者可能从靶向免疫疗法中受益。然而，目前的TIL检测充其量是半定量的，因此缺乏临床应用所需的精确度。

Jason Bielas博士和他的团队就在利用基于ddPCR的QuanTILfy分析来测定各种癌症类型中的TIL，包括卵巢癌。他们的研究成果于去年底发表在《科学转化医学》（Science Translational Medicine）杂志上，表明TIL数量较高与卵巢癌患者存活率改善之间的关联，这表示针对卵巢癌的免疫反应可以看作是个有意义的预后指标。

据Bielas博士介绍，TIL具有一种可被数字化利用的基因组特征。这个特征表现出巨大的多样性，决定了每个TIL表面表达的T细胞受体（TCR）的遗传特征。随着数字PCR的出现，如今能够定量这些特征，确定TIL的数量。

“除了微滴式数字PCR，你无法使用其他方法，因为我们有很多引物对和探针（45个正向引物、13个反向引物和30个探针），”Bielas博士谈道。“微滴式数字PCR分开所有反应，这样你就能独立扩增这些目标，且不会有任何竞争性的副反应。”

Bielas的团队利用QuanTILfy对TIL进行计数，确定它们的频率，并开发出一个分组系统对“克隆性”进行分类，这可能是可药性靶点的一个标志物。

他们对30名卵巢癌患者的原发肿瘤开展QuanTILfy分析，这些患者的生存期从1-122个月不等。与那些存活率不足两年的患者相比，存活率超过五年的患者的TIL频率大约高3倍。这些结果表明，TIL水平较高与患者存活率呈正相关，这与TIL在抑制肿瘤形成上发挥积极作用的假说一致。

研究已证实，QuanTILfy分析是灵敏且准确的。在从血液和正常人类肺成纤维细胞中纯化出的T细胞混合物中，此分析能够检测到大约10,000个肿瘤细胞中的单个TCR重排。重要的是，它也表明，ddPCR技术能在单个反应中同时定量大量标志物。

所有这一切的结论很明显。Bielas博士认为：“如今我们具备了定量肿瘤中TIL的灵敏度和能力。我们也许能根据肿瘤TIL的计数对患者进行分层并更有效地治疗，特别是在免疫疗法进入市场时。”

（来源：BioRadiations，作者：Kara Turtinen & Rachel Lear）

参考文献

Hindson CM et. al.(2013). Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods 10, 1003-1005.

Robins HS et. al. (2013). Digital genomic quantification of tumor-infiltrating lymphocytes. Sci Transl Med 214.