Caspase检测产品全接触（上）[选购宝典]

凋亡（Apoptosis），又称程序性细胞死亡，是机体维持稳定状态最重要的机制之一。成年人每天有500-700亿个衰老或损伤的细胞发生凋亡；即使是年龄在8-14岁的孩子，每天也有200-300亿个细胞发生凋亡。凋亡若出现异常，则会引发疾病。比如凋亡过度可能引起老年痴呆症，而凋亡不足则会导致肿瘤发生。

这是个复杂的生化过程，涉及到一系列分子、信号和通路。凋亡的一个重要标志就是caspase的激活。caspase是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡、坏死和炎症中发挥重要作用。目前已确定了caspase家族的12个成员，其中一些被称为启动者（initiator caspases），刺激凋亡开始的信号级联，如caspase-2、8、9和10，而另一些被称为执行者（effector caspases），执行凋亡过程，如caspase-3、6和7。

作为凋亡检测的大热门，市场上多家公司提供caspase检测试剂盒，包括Life Technologies、Promega、默克密理博、罗氏等。这些试剂盒或基于荧光或显色读取，或通过流式细胞仪检测，为caspase分析提供了简便而多样的选择。

微孔板分析

基于微孔板的caspase分析通常是采用荧光和显色检测。它利用caspase酶的活性和特别设计的报告底物来产生荧光或显色的信号，这可通过酶标仪读取，或在显微镜下成像。这个底物通常是个短肽，其中包含caspase酶识别序列，并与显影剂分子相连。一旦切割底物，显影剂分子就变色或发出荧光，其强度与分析中存在的caspase活性成正比。

由于不同细胞之间的凋亡往往是相似的，可以预见caspase酶的底物在进化上是保守的，至少在切割位点上是如此。caspase有着内在的底物特异性，其偏爱的切割位点如下图所示。不过，它们也存在重叠的底物特异性。例如，多聚ADP核糖聚合酶（PARP）及其衍生的四肽DEVD几乎能被所有caspase切割，但caspase-3和caspase-7在切割PARP上是最高效的。

基于此，罗氏诊断推出了Homogeneous Caspases Assay。这是个一步法的荧光分析，所采用的底物是DEVD-罗丹明110，能检测caspase-2、3和7，同时检测caspase-6、8、9和10。因此，它能作为一款筛选工具，用于总的凋亡测定。

细胞在微孔板中培养，并诱导凋亡。之后加入细胞裂解液和caspase底物（DEVD-R110），并孵育1-2小时。底物被激活的caspase切割，释放出荧光基团罗丹明110。通过测定荧光强度，可以获知激活caspase的浓度。此分析使用96或384孔板和荧光酶标仪，特别适合高通量地筛选数百种可能引起凋亡的化合物。不过，若要确定更多信息，比如具体哪种机制引起凋亡，则需要特定的分析。

Abcam则提供单独每个caspase酶的检测试剂盒，大多数都有两种可以选，显色或荧光。比如，caspase-9的显色检测使用与发色团对硝基苯胺（p-NA）相连的LEHD，而荧光检测则使用与AFC相连的LEHD。

相对于显色分析而言，荧光分析的灵敏度要高出10到100倍，有时也能够测定更宽的动态范围。另一个优点就是荧光分析往往有着较低的背景，因为唯一对信号有贡献的就是释放的荧光基团。不过，荧光caspase分析需要专门的仪器（荧光酶标仪）和耗材（黑色微孔板和特殊滤光片），这可能导致额外的成本。

检测caspase活性的另一个选择是均质发光检测（luminescence）。据Promega介绍，这种检测的好处在于灵敏度增加，它通常是荧光分析的50-100倍。这样实现了分析的小型化，达到384甚至1536孔板形式，适合高通量的筛选应用。

Promega目前提供Caspase-Glo® 系列检测试剂盒，分别适合Caspase-3/7、8、9、2或6活性的检测。试剂盒中提供了一种氨基萤光素发光前体底物（含蛋白酶识别序列）和专利的耐热萤光素酶，试剂已经经过优化。加入Caspase-Glo® 试剂会导致细胞裂解，随后caspase将底物切割。释放出的游离氨基萤光素被Ultra-Glo 重组萤光素酶作用后产生一种"辉光型"的发光信号。该信号的强弱与caspase的活性成正比。

稳定的萤光素酶和专利的缓冲液使得这些试剂盒在不同的实验条件下都能发挥很好的性能。不同于荧光或比色分析法，该发光分析法不易被其他化合物的干扰而影响。分析采用“加样-混合-检测”三个简单步骤，无需洗涤或去除培养基，使得自动化操作成为可能。发光信号长达3小时，有助于批处理。当然，它需要发光检测仪（luminometer），如GloMax® 96微孔板发光检测仪。

基于微孔板的Caspase分析以高通量、高速度带来了所有细胞的平均Caspase活性，不过，如果你不想要平均值，而是想了解单个细胞的Caspase活性，那就要求助于流式细胞仪了。（生物通 余亮）

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