单细胞分析 样品制备怎么破[创新技巧]

【字体: 时间:2014年08月18日 来源:生物通

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  单细胞基因组学顾名思义,研究人员分离出单个细胞并裂解,然后扩增并测序基因组DNA。它所产生的组装可能并非完整的,因为任何损失或扩增偏向都会导致序列数据丢失,不过,它带来了其他方法无法获得的信息。现在的问题是,如何分离单个细胞。

物以稀为贵,这对于很多无法培养的细菌而言,更是如此。它们代表了珍贵的微生物种类。斯坦福大学的Stephen Quake教授曾说过,已经被培养的细菌种类不足1%。

鉴于无法培养的生物体在它们所居住的环境中扮演了关键的角色,这种信息鸿沟代表了一个重大的问题,Quake的团队将其称之为生物学中的“暗物质”问题。从更实际的角度来看,这些细胞也许含有新颖的酶以及生物学或药学上有用的分子,如抗生素。

研究人员已经设计出几种策略来研究无法培养的微生物,包括16S rRNA测序和宏基因组学。不过,现在还有另一种越来越流行的方法:单细胞基因组学。

单细胞基因组学顾名思义,研究人员分离出单个细胞并裂解,然后扩增并测序基因组DNA。它所产生的组装可能并非完整的,因为任何损失或扩增偏向都会导致序列数据丢失,不过,它带来了其他方法无法获得的信息。现在的问题是,如何分离单个细胞。

单细胞分离策略

据美国能源部微生物基因组学计划的主管Tanja Woyke介绍,研究人员使用几种方法分离单细胞,它们各有优缺点。

Quake曾使用微流体方法来分离一种称为TM7的无法培养微生物1。TM7是杆状的,于是Quake及其团队专门捕获口腔微生物群落中的杆状细菌。随后他们通过核糖体RNA来追踪所要的细胞。在35个分离的杆状细菌中,4个都证明是TM7,他们对其中一个进行测序。

Woyke认为,微流体方法有两个主要优势。第一,用户能够观察他们正在分离的细胞,这让他们能够选择特定的形态或表型,并将此信息与基因型相关联。第二是扩增效率。单拷贝的细菌基因组显然不够用来测序,因此需要全基因组扩增。但并非所有片段都能同等扩增,一些可能会丢失。“一些研究表明,如果反应体积越小,那么单细胞基因组的回收就越好,覆盖也更加均一,”Woyke说。

尽管如此,微流体策略通常是低通量的,且只有少数实验室能够接触到这种设备。一个商业化的选择是Fluidigm的C1™单细胞自动制备系统,这个微流体系统能够自动化分离和制备96个单细胞的测序文库。不过,它只适用于哺乳动物细胞,目前不支持细菌分离。

另一种单细胞分离方法是显微操作,其中研究人员使用操纵杆驱动的玻璃毛细管来挑选单个细胞,并依次转移到目的容器中。

Woyke表示,她偶尔会使用这种方法,主要是在处理低复杂度的样品时,在2010年发表的一篇文章中,她和她的同事对一种昆虫的细菌共生体进行测序,根据它独特的形态将其与另一种共生体分离2。“这就是主要优势,”Woyke说。“你可以看到细胞。”不过,显微操作的通量也非常低。若细胞能游动或有粘性,则很棘手。

受欢迎的FACS

在微生物单细胞基因组学中,两种比较少用的分离方法是激光捕获显微切割和连续稀释,而Woyke对后者的评价是“最便宜且最不准确”的选择。

最流行的策略是荧光激活细胞分选(FACS)。比奇洛海洋科学实验室(Bigelow Laboratory for Ocean Sciences)单细胞基因组学中心的主任Ramunas Stepanauskas使用两台FACS仪器,一台是贝克曼•库尔特的MoFlo™,另一台是BD的BD™ Influx™。他对细胞分选的看法是:“这是个非常强大且高通量的技术,经过了几十年的开发和改进。它让我们能够在几分钟内处理数千个细胞。”


与其他方法相比,FACS带来了两个主要优势。其一是通量,流式系统能够快速将单个细胞分选到384孔板中,这一速度是手动方法难以企及的。其二是FACS能够按照特定条件来选择细胞,如特定颜色、核酸或生物化学活性的存在。

Woyke、Stepanauskas及其同事在2014年的《Nature Protocols》文章3中写道:“由于其高的速度和通量,以及根据各种细胞特性分离单个细胞的能力……FACS已成为[单细胞基因组学中]首选的单细胞分离方法。”

2012年,Stepanauskas通过将样品与荧光标记的海带多糖和木聚糖一起孵育,分离出能够降解某些多糖的水生细菌4。他们还利用CTC(5-氰基-2,3-苄基-四唑氯化物)富集具代谢活性的细胞。

另一方面,传统的FACS不可能捕获你正在收集的各个细胞的图像。而且由于它的体积比微流体方法更大,之后的扩增效率可能受影响,Woyke谈道。她的解决方案是使用Labcyte的Echo® 来代替传统的液体处理系统,这一系统利用声能来分配纳升级液体,让反应体积最小化。

据BD Biosciences的副总裁Robert Balderas介绍,如今的细胞分选仪能够根据多达20个参数(如细胞大小和颗粒度)来过滤细胞,颜色可达到18种。

他认为,任何分选仪都能开展单细胞的工作,不过它们的能力有所不同。最重要的是用户的需求。他们是否需要从复杂的混合群体中分离特定的细胞群,需要更复杂的分选策略,以及更多的颜色?“最重要的事情是科学,”他说。

远离污染

Woyke认为,单细胞基因组学成功的关键是清洁度。“污染是我们在单细胞基因组中的重大敌人,”她说。由于所使用的DNA量极少,痕量的污染也会在扩增后放大,因此从头到尾都需要一个非常干净的过程,一块专门的区域,以及专门的移液器和液体处理系统。

除此之外,用户需要做的就是照着Protocol来做,这并不难。Woyke指出,有些公司如今提供专为单细胞基因组扩增而设计的超纯试剂盒,能尽量避免污染问题。(QIAGEN的REPLI-g试剂盒就是这样的产品,索取详细资料。)

尽管如此,考虑到复杂性、仪器和数据分析问题,Stepanauskas认为单细胞基因组学方面的新手可能会考虑外包。“你需要专门的设备和诀窍才能做好。我不建议人们包揽一切,”他谈道。

(作者 Jeffrey M. Perkel/生物通编译)

参考文献

[1] Marcy, Y, et al., “Dissecting biological ‘dark matter’ with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated TM7 microbes from the human mouth,” PNAS, 104:11889-94, 2007. [PubMed ID: 17620602]

[2] Woyke, T, et al., “One bacterial cell, one complete genome,” PLOS ONE, 5[4]:e10314, 2010. [PubMed ID: 20428247]

[3] Rinke, C, et al., “Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics,” Nat Protocols, 9[5]:1038-45, 2014. [PubMed ID: 24722403]

[4] Martinez-Garcia, M, et al., “Capturing single cell genomes of active polysaccharide degraders: An unexpected contribution of Verrucomicrobia,” PLOS ONE, 7[4]:e35314, 2012. [PubMed ID: 22536372]

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