提高MSC的扩增且不损失其分化潜能

Anissa S.H. Chan, Electra Coucouvanis, Susan Tousey, Marnelle D. Andersen and Jessie H.T. Ni Stem Cell and Developmental Biology Department, R&D Systems, Inc., 614 McKinley Pl. NE, Minneapolis, MN, 55413

摘要

骨髓间充质干细胞（MSC）为组织工程学和再生医学带来重大希望。临床及临床前对MSC的应用需要它们在培养基中以最大效率扩增，并且维持分化为主要细胞系的能力。胎牛血清（FBS）是一种体外维持hMSC生长的要素，但是批次之间的差异能明显影响实验结果。为了制造能始终如一地使hMSC最优扩增的生长培养基，我们测试了几种来源的FBS的不同浓度。我们的结果表明FBS样品间的扩增效率差异很大，一次传代后可扩增1.8至4.2倍。使hMSC最大扩增的FBS批次用于开发StemXVivoTM骨髓间充质干细胞扩增培养基。与另一种市上MSC扩增培养基作比较测验，用StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基传2代后可以扩增5.6倍，相比之下，竞争者的培养基只扩增2.8倍。然后，我们力图证实在StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基中扩增的细胞保有全部的分化潜能。我们分析了扩增后的细胞表型，发现它们是CD105+，CD90+和CD34-。我测试它们分化为软骨细胞，骨细胞和脂肪细胞的能力。种系特异的抗体染色证明了这些细胞可以有效地分化为软骨细胞，骨细胞和脂肪细胞。因此，我们表明通过对几批FBS的提前筛选而制造的扩增培养基具有最大MSC扩增效率，而且不会损害MSC的多能性。

引言

骨髓间充质干细胞或者骨髓基质细胞（MSCs）是具有多种系潜能的成人干细胞，它们便于基因改造并且具有免疫抑制能力。它们用途广泛，为组织工程学，再生医学和免疫疗法带来希望。包括骨髓，骨膜，骨小梁，脂肪组织，滑膜，骨骼肌和乳牙在内的许多组织都有MSCs。它们能分化为骨，软骨，肌肉，骨髓，腱，脂肪和结缔组织（图1）。怀着对在体和体外实验深入研究的希望，我们有兴趣优化培养和扩增MSC的培养条件，同时保留MSC的多能性和分化能力。为了评估不同来源和浓度的血清对MSC扩增的影响，我们用市上分化试剂盒和组分严格地测试了每种FBS对最大扩增潜能，维持hMSC表型特性和扩增的MSCs分化为脂肪细胞，骨细胞，软骨细胞的影响。我们通过对FBS的筛选开发了StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基。

我们的研究强调利用为研究hMSCs而开发，优化和测试的市上产品的优点。

我们的研究强调使用商品化产品的优势。为了hMSCs的研究，这些商品化的产品都已经被改善，优化，并且进行了检测。

材料和方法

人MSC 的培养。人MSCs（hMSCs ） 购于Cambrex（ Lonza, Walkersville），先根据供应商的说明书培养，然后用StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基（ 目录# CCM004；R&D Systems，Minneapolis）培养。为了测试不同批次FBS的扩增潜能，每种FBS以终浓度为10% 或20% 加入含有谷氨酰胺，丙酮酸钠（Irvine Scientic， Santa Ana） 的α-MEM 培养基（Invitrogen，Carlsbad）。将1.25×105量级的hMSCs接种于一个T75长颈瓶，在细胞汇聚之前让细胞生长3至4天。在培养期末，培养于不同条件的hMSCs同时用胰蛋白酶/EDTA溶液（Irvine Scientic）收集。对细胞计数，并且用下面的公式计算扩增倍数。重新培养时，将1.25×105量级的hMSCs接种于一个新的T75长颈瓶，并用适当的培养基培养。每次传代后对细胞进行计数。

抗体。藻红蛋白（PE）连接的小鼠抗人CD90和CD105的单克隆抗体（mAbs），PE非连接的山羊抗小鼠FABP-4多克隆抗体，PE非连接的小鼠抗人骨钙蛋白单克隆抗体，PE非连接的山羊抗人聚蛋白多糖多克隆抗体，PE连接和非连接的同型对照，NorthernLights-557连接的驴抗山羊和驴抗小鼠的二抗都采购于R&D Systems。PE连接的小鼠抗人CD34单克隆抗体源于BD Pharmingen（BD Biosciences，San Jose）。

流式细胞术。hMSCs的收集如上所述。细胞用2×冷FACS缓冲液冲洗（含有2%FBS和叠氮化钠的PBS），然后以每毫升106量级细胞的密度重新悬浮于FACS缓冲液中。2至8℃下，1×105量级的hMSCs用PE连接的单克隆抗体或者同型对照孵育45分钟。被染的细胞用2×冰冷FACS清洗，然后用FACSCalibur（BD Biosciences, SanJose）获取数据，用CellQuest软件（BD Biosciences）分析数据。

免疫细胞化学。人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒（ 目录#SC006, R&D Systems）的内单上有详细步骤。简而言之，室温下用含有4%多聚甲醛的PBS固定培养于盖玻片上的细胞20分钟，然后室温下用含有10%标准驴血清，0.3%Triton X-100和1%BSA的PBS封闭45分钟。封闭后，在2至8℃下用稀释的一抗孵育细胞过夜，然后在室温下的暗室中用NorthernLights-557连接的二抗孵育细胞一个小时。每一个步骤间，细胞用含有0.1%BSA的PBS清洗三次。

成脂分化。按人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒的说明书诱导hMSC分化为脂肪细胞，骨细胞或软骨细胞。简而言之，准备完全成脂分化培养基和带有无菌盖玻片的24孔组织培养皿，将5 mL α-MEM基础培养基中3.7×105量级的hMSCs植入培养皿的十个孔中。37℃下，培养皿在含有5% CO2的增湿孵化器中孵育，第二天细胞会汇合，弃掉培养基，然后加入0.5 mL的成脂分化培养基。每3至4天更换一次分化培养基，7天后脂肪细胞可见。第21天固定脂肪细胞，然后用免疫细胞化学技术鉴定。

成骨分化。用StemXVivo人/小鼠成骨基础培养基（目录#CCM007；R&D Systems）和StemXVivo人成骨补充剂（目录#CCM008；R&D Systems）诱导hMSCs分化为骨细胞。将0.5 mL完全成骨基础培养基中7.4×103量级的hMSCs植入含有无菌盖玻片的24孔培养皿的每个孔中。37℃下，培养皿在含有5% CO2的增湿孵化器中孵育1至2天，直至50%至70%的细胞汇合，然后用0.5 mL的完全成骨分化培养基替换每个孔中的培养基。每3至4天更换一次分化培养基，14天至21天期间骨细胞可见。用免疫细胞化学技术鉴定分化的骨细胞。

成软骨分化。用S temX Vi v o 人/ 小鼠成软骨基础培养基（ 目录#CCM005；R&D Sys tems）和StemXVivo人成软骨补充剂（目录#CCM006；R&D Systems）诱导软骨细胞分化。简而言之，将2.5×105量级的hMSCs移入一个含有5 mL预热完全成软骨基础培养基的15 mL锥形管中，然后200×g离心5分钟。将hMSCs重悬于0.5 mL预热的完全成软骨分化培养基中，然后200×g离心5分钟。不破坏管底形成的细胞团，旋松锥形管的盖子让气体交换，然后37℃下，在含有5% CO2的增湿孵化器中直立孵育。每2至3天更换一次分化培养基，14天至21天后收获软骨细胞团。对软骨细胞团进行固定，切片，然后用免疫细胞化学技术分析。

结果和图表

MSC的扩增随不同的血清样本而变化

图2. 三种不同的FBS样本对人MSCs扩增的作用。如材料方法中所描述的，用终浓度为10%或20%的三种不同FBS样本培养1.25×105量级的第四代hMSCs。 在第3天或第4天收集扩增的hMSC，计数并接种于一个新的长颈瓶中。如材料方法中所描述的方法对细胞扩增进行计算。结果取自第5和第6连续两代。符号 指示数量很少的细胞，不进行计数。

结果：测试不同FBS与α-MEM基础培养基的组合，结果表明不同的FBS样本会使hMSC的扩增有本质差异，使用FBS-3的扩增多于FBS-2或FBS-1。把FBS-3的浓度从10%增加到20%，使第5代的扩增倍数从3.3增加到4.3，使第6代的扩增倍数从4.6增加到5.6。

扩增的MSC维持正确的表型

图3. 生长在StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基中的hMSCs表现出更高的扩增潜能，同时保有MSC的特性。图A. 同图2图例所描述的一样，在相同条件下，用CCM004（深灰色柱）或者竞争者的培养基（浅灰色柱）培养hMSCs，展示的是第5，第6代的典型结果。图B. 流式细胞分析第6代扩增细胞表面表达的CD90，CD105和CD34（实心直方图），展示同型对照（空心直方图）。

结果：StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基比竞争者的培养基具有始终如一的更高的细胞扩增潜能，对比于竞争者培养基2倍的扩增，StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基在第5和第6代有4至5倍的扩增。就表型而言，扩增的第6代hMSC大量表达关键MSC标识物CD105和CD90，但是不表达CD34表面标识物，提示扩增的细胞保有hMSC特性。

扩增的MSC维持分化潜能

图4A. 扩增的hMSCs表现出成脂潜能。上图：用人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒（SC006）使扩增hMSCs成脂分化的示意图。底下图片展示21天分化的脂肪细胞用抗FABP4抗体（红色）染色，并用DAPI（蓝色）复染。图片是10倍镜下拍摄。

图4B. 扩增hMSCs的骨形成。上图：用StemXVivo人/小鼠成骨基础培养（CCM007）和StemXVivo人成骨补充剂（CCM008）使扩增hMSCs成骨分化的示意图。底下图片展示21天分化的骨细胞用抗骨钙蛋白抗体（红色）染色，并用DAPI（蓝色）复染。图片是20倍镜下拍摄。

图4C. 扩增hMSCs的软骨形成。上图：用StemXVivo人/小鼠成软骨基础培养（ CCM005 ） 和StemXVivo人/小鼠成软骨补充剂（CCM006）使扩增hMSCs成软骨分化的示意图。底下图片展示21天分化的软骨细胞用抗聚蛋白多糖抗体（红色）染色。图片是20倍镜下拍摄。

总结

图5. 沿脂肪细胞系，骨细胞系和软骨细胞系扩增分化hMSCs的培养基指南。用StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基培养扩增hMSCs，用所列培养基和试剂诱导骨形成，脂肪形成和软骨形成，所有这些试剂都在人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒中。

所选的R&D Systems骨髓间充质干细胞产品

结论

1. 通过对FBS的来源，批次和浓度的严格检测，我们鉴定一系列MSC培养基的效果。我们利用这些数据开发了人/小鼠StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基，该培养基优于其他市上扩增培养基。
a．对比于领先的竞争者的扩增培养基，StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基使hMSC更高倍地扩增。
b．用StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基培养扩增的hMSCs保有MSC表型，表现为具有关键的MSC标识物CD105和CD90，并且没有CD34。
c．扩增的hMSCs保有成脂分化，成骨分化和成软骨分化的全部潜能。

2. 结合我们用于MSC分化的培养基和试剂，StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基提供了一个完整的研究生产线，它可以促进对hMSC，脂肪形成，骨形成和软骨形成的研究。