原代细胞转染的实用工具

【字体: 时间:2014年08月21日 来源:生物通

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  现代分子生物学研究,很大程度上依赖于向细胞引入遗传物质的能力。然而,要做到这一点并不那么容易,尤其是在细胞缓慢分裂甚至不分裂的情况下。原代细胞就是这样一个转染难题,不过人们已经为此开发了许多趁手的工具。

生物通报道:现代分子生物学研究,很大程度上依赖于向细胞引入遗传物质的能力。然而,要做到这一点并不那么容易,尤其是在细胞缓慢分裂甚至不分裂的情况下。原代细胞就是这样一个转染难题,不过人们已经为此开发了许多趁手的工具。

瞬时转染很有用

将核酸送入细胞主要有三条途径。第一条途径属于化学方法,旨在减少带负电的细胞对带负电核酸的排斥,促使细胞膜通过胞吞、胞饮或融合摄入附着其上的颗粒。第二条途径属于物理方法,包括电穿孔、显微注射和基因枪、磁转染等等。第三条途径是利用病毒(或类病毒颗粒)来递送核酸,这一过程也被称为转导。转导是将DNA转入细胞并使之表达的一种保险的方法,这种方法对操作者有较高的专业要求,比较耗费时间,而且存在一定的生物安全性问题。

人们总是希望能够获得稳定表达目的基因或转录本的细胞系。然而就算一切顺利,建立这种稳定细胞系也是一项很麻烦的工程。含有目的基因的DNA必须要进入细胞核,整合到宿主基因组中(或者成为自我复制的附加体episome),并由此得到转录和翻译。

完成上述步骤可能需要六到八周,而后才能进行抗生素筛选,Altogen LabsCEO Dmitriy Ovcharenko说,该公司为用户提供包各种临床前的研究服务。正因如此,研究者们通常会先用瞬时转染试一试自己的质粒载体,“一般在转染后4872小时内就能看到蛋白表达,有时也会需要96小时,”Ovcharenko说。瞬时转染可以帮助研究者们快速确定,细胞是否能够很好的耐受质粒的编码产物(蛋白甚至是miRNA)。

mRNAsiRNA送入细胞(替代DNA质粒),能够快速尝试转录本在细胞内的效果,特别适合研究那些不分裂或者难转染的细胞,例如神经元和原代T细胞。尽管瞬时转染的效果可能只持续几天,但RNA转染起来要容易得多,因为它不需要进入细胞核就能够发挥作用。(延伸阅读:如何选择siRNA转染试剂

稳定转染的实用工具

要实现长期稳定表达,外源基因必须能够留在宿主细胞中并且与之一同复制。要在原代细胞中达成这一目标,标准方法是使用电穿孔进行转染。不过,各大公司也为这些难以转染的细胞,提供了多种可以实现稳定转染的试剂和试剂盒。

Promega公司的FuGENE® Life Technology公司的Lipofectamine®已经成为了通用转染试剂中的经典。其他通用型产品也层出不穷,比如Incella公司的ScreenFect®AATCCTransfeX™

 


许多公司还推出了专门为特定细胞类型量身打造的试剂和转染方案。举例来说,EZ Biosystems公司网站上列出了33种针对不同原代细胞的Avalanche™转染试剂,从人动脉内皮细胞、尿道黏膜上皮细胞到小鼠胚胎成纤维细胞。Cell Applications公司的Cytofect™ 成纤维细胞转染试剂盒,分别为原代的真皮、心脏和肺成纤维细胞提供了相应的优化方案。

“特别针对原代细胞的转染试剂含有特殊的配方,而且经过了有针对性的测试和优化,能够在维持细胞活力的同时提供最佳的转染效率,”Bio-Rad公司的Teresa Rubio说。

不过,产品资料难免有自卖自夸之嫌,评估转染试剂的效率和毒性最终还是得靠我们自己。没有哪个转染试剂是万能的,因此实验室里最好能多做几手准备。“事实上,人们对细胞转染的生化机制还没有足够的理解,无法根据制定的细胞和应用预测哪个试剂最好用,”Incella公司的首席科学家Pavel Levkin坦陈。“因此,如果想要获得最高的转染效率,根据细胞类型进行优化是非常重要的。”

一步一步来

Ovcharenko建议我们在转染原代细胞之前,先选择一组转染试剂进行优化和比较,可以是通用型试剂也可以是专门针对特定细胞的转染试剂。“如果这些试剂的转染效率都不理想,”他说。“那么就应该尝试一下电穿孔。”

市面上形形色色的电穿孔仪也不少,也都配备了各种相应的试剂。有些系统(Lonza公司的Nucleofector™)使用专利的预设程序,其他则大多是开放式系统,允许用户对一些参数进行编辑。

“从最终的功能上看,现在市面上的电穿孔仪是非常相似的,”Thermo Fisher公司(最近收购了Life Technologies)负责转染产品的James Lovgren说。关键在于如何设定最佳参数,“将核酸有效送入细胞,同时尽量减少对细胞的影响。只有二者达到一定的平衡,细胞才能在电穿孔处理中存活下来。”

Alabama大学的Randy Cron教授用Nucleofector来转染原代T细胞。这一系统可以在细胞质和细胞核的膜上打孔,他解释道。这样有利于把核酸送入细胞核,但也会影响到钙离子流量,提高CD4+ T细胞活化标志的表达。Cron提醒其他用户在设计实验和解读结果时注意这一点。

如果电穿孔也无法达到足够的转染效率,“那就只能用上我们最后的武器——病毒载体,”Ovcharenko说。虽然病毒递送的效率最高,但这种方法需要大量的克隆和优化工作,还要采取相应的安全防护措施,其他方法都没这么麻烦。

在原代细胞中实现外源基因的长期稳定表达,一直是个很棘手的工程,但我们也不必因此而灰心丧气。前辈们已经为此作了大量的工作,查查文献和供应商提供的资料往往会让我们获益匪浅。

参考文献:

[1] Zhang, M, et al., “The impact of Nucleofection® on the activation state of primary human CD4 T cells,” Journal of Immunological Methods, 408:123–31, 2014. [PubMed ID: 24910411]

Josh P. Roberts撰写/叶予编译)

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