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多种工具带你深入DNA甲基化

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年9月19日 来源:生物通

摘要:

  研究者们通过检测基因组的表观遗传学状态,鉴定了大量值得深入研究的甲基化区域。应该如何进一步研究或验证这些区域呢?对大量样本进行全基因组扫描显然是不现实的,这样做的成本太高。实际上,也没有必要为了部分区域去检测整个基因组DNA,本文介绍的工具就足以完成这样的任务。

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生物通报道:近年来,表观遗传学尤其是DNA甲基化引起了人们极大的研究热情。在芯片和二代测序技术的帮助下,研究者们通过检测基因组的表观遗传学状态,鉴定了大量值得深入研究的甲基化区域。

应该如何进一步研究或验证这些区域呢?对大量样本进行全基因组扫描显然是不现实的,这样做的成本太高。实际上,也没有必要为了部分区域去检测整个基因组DNA,本文介绍的工具就足以完成这样的任务。

甲基化特异性PCR

甲基化特异性PCR以重亚硫酸盐为基础,是评估少量位点甲基化状态的一种常用方法。

用亚硫酸氢钠处理甲基化DNA,可以将未甲基化的胞嘧啶残基转变为尿嘧啶,而甲基化残基保持不变。特殊设计的PCR引物能够加以区分,然而人们可以根据扩增产物来量化给定位点的甲基化状态。

许多研究者都会在亚硫酸氢盐转化之前,先富集甲基化的DNA。这样不仅能够降低背景,也可以节约成本。Active Motif公司就提供有这样的甲基化富集工具,MethylCollector™ Ultra kit利用含有甲基-CpG结合结构域(MBD)的蛋白来捕获甲基化序列,而 MeDIP kit使用anti-methyl抗体来完成这项工作。

Active Motif公司的表观遗传学产品经理Kyle Hondorp介绍到,这两种方法虽然理论上是一样的,但也存在着细微的差异。Anti-methyl抗体能够检测任何甲基化事件,除了传统的哺乳动物CpG甲基化,还有CpACpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。但MBD不能识别CpACpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。另外,MeDIP抗体只识别单链DNA中的甲基化,而MBD能识别双链DNA

限制性酶切

这种分析依赖于能够区分甲基化和非甲基化序列的酶。

有些限制性内切酶可以区分甲基化和非甲基化序列,比如HpaII MspI(切割C^CGG),还有AccII(切割CG^CG)。这些酶对DNA的甲基化状态的敏感,切割甲基化和非甲基化序列的效率不同。酶切之后可以通过qPCRPCR读取结果,也可以用HELP assayHpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR)进行分析。

酶切法能达到接近单核苷酸的分辨率,同时又避免了重亚硫酸盐对DNA造成的损害。(延伸阅读:鉴别DNA甲基化,总有一款工具适合你http://www.ebiotrade.com/newsf/2012-8/2012824152312670.htm

质谱分析

收购了Sequenom生命科学业务的Agena Bioscience,在MassARRAY® Analyzer 4的基础上开发了EpiTYPER®,这是一个MALDI飞行时间质谱仪。

这一策略也是先用亚硫酸氢盐进行处理,将DNA中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。随后通过DNA回收和PCR扩增,分离出500-bp左右的目的区域。在体外将扩增产物转录为RNA并用RNAse A处理,这种酶会在尿嘧啶后面切割,酶切生成的片段化模式依赖于DNA的甲基化状态。这些片段化的RNA产物,可以在MassARRAY Analyzer中进行分析。

Agena 公司的Robin Everts介绍,这种分析法可以评估PCR片段上的多个CpG位点(≥20个位点/片段)。“这是一个验证工具,”Everts说。“如果你在全基因组甲基化筛查中发现了感兴趣的区域(高甲基化或低甲基化的区域),就可以用质谱分析在大量样本中检测相应的扩增子。”

羟甲基胞嘧啶

一般的甲基化检测工具很难区分5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)。

 

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