如何预测和鉴定miRNA的靶基因？

近年来，因诊断和治疗方面的潜力巨大，microRNA（miRNA）研究正在快速增长，这也带动了全球miRNA工具和服务市场的发展。据Frost & Sullivan公司预计，到2017年，全球miRNA市场的规模有望突破3亿美元。

miRNA虽只有短短22个核苷酸，却通过调控大量的靶基因，在基因表达中扮演了重要角色。研究发现，每个哺乳动物miRNA可能调控了约200个靶基因。到目前为止，仍有许多miRNA的功能并不清楚，原因在于已经确定的miRNA靶基因数量很少，而靶基因的预测和鉴定的难度又颇大。于是，科学家们也在利用各种生物信息学方法和实验方法来寻找miRNA的靶基因。

生物信息学方法

鉴定miRNA靶基因的最常用方法是依赖计算机算法，如TargetScan、MiRanda和PicTar。它们预测miRNA种子区的结合。种子区（seed region）指的是miRNA上进化最为保守的片段，从第2个到第8个核苷酸，通常与mRNA 3’-UTR上的靶位点完全互补。

每种算法都有自己独特的一套规则，但主要遵循以下几个基本原则：miRNA 与其靶位点的互补性；miRNA 靶位点在不同物种之间的保守性；miRNA-mRNA 双链之间的热稳定性；miRNA 靶位点处不应有复杂的二级结构等。当然，具体允许有多少个错配，哪里有错配，这就因算法而异了。

然而，这种搜索还是颇具挑战性，因为动物miRNA:mRNA双链往往含有错配、缺口或凸出，而且目前明确的miRNA靶基因并不多，在算法编写过程中没有足够的样本可以参考，因此，搜索并不时时奏效。不过，对于分值最高的匹配，后续实验的成功率还是挺高的。以下便是人们常用的miRNA靶点预测工具。

TargetScan

TargetScan（targetscan.org）由麻省理工学院的Benjamin Lewis等人在2003年开发，它通过搜索与每个miRNA的种子区匹配的保守位点而预测miRNA的靶基因。作为一个选项，非保守位点也可预测。与其他的目标预测工具不同，TargetScan提供每个miRNA预测靶点的准确排名。这些排名是基于进化上保守的靶定概率（PCT得分）或抑制的预测效果（背景+得分）。

TargetScan目前包括TargetScanHuman、TargetScanMouse、TargetScanFish、TargetScanFly和TargetScanWorm，分别围绕人、小鼠、斑马鱼、果蝇和线虫的基因提供预测。目前最新的版本是TargetScan 6.2。

miRanda

miRanda（www.microrna.org/）是一个利用生物信息学对 miRNA 靶基因进行预测的软件，由Sloan-Kettering纪念癌症中心的Anton Enright等人在2003年设计开发，以C语言编写。miRanda 对 3’-UTR 的筛选依据主要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳定性以及靶位点的保守性三个方面进行分析。

PicTar

PicTar（pictar.mdc-berlin.de）则由纽约大学的Azra Krek等人在2005年开发。与大部分算法一样，PicTar同样强调种子区在靶位点识别及在转录后调控中的关键作用。不同的是，PicTar把种子序列分为“完全匹配种子序列”和“不完全匹配种子序列”，前者要求种子序列和靶基因完全互补配对，后者在满足 miRNA 与靶基因结合自由能不增加的前提下允许种子序列出现错配, 但不允许G:U配对。

有些研究人员会选择用多个工具来预测miRNA的靶基因，并找出所预测的交集，但是每个软件预测出来的靶基因都为数众多，有些甚至有几千个，怎么办？笨办法就是建个excel，输入多个结果，查询各个结果之间的重叠情况。这个方法很有效，但相当费时，这里推荐个工具miRWalk数据库（www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）。它也能帮助你找出预测结果的交集。

实验方法

预测miRNA靶基因的算法虽然在不断升级，但计算机模拟仍有一定的局限性，研究人员也希望通过实验方法来更直观地寻找miRNA靶基因。这些年，人们开发出不少方法，或从mRNA或蛋白表达的变化入手来寻找靶基因，或者更直接，确定miRNA与mRNA之间的相互作用。而新技术（如NGS）的崛起，也为这一领域增添了新的活力。

基因表达分析

对于大规模的寻找，芯片或测序都是个不错的选择。我们可以提高或抑制miRNA的活性，然后通过芯片分析或RNA-Seq来研究mRNA表达的变化。不过，芯片更快一点，而测序更深一点。

通过瞬时转染或病毒转导来过表达miRNA或模拟物，可以提高miRNA活性，不过要小心脱靶效应（off-target effect）。同样地，通过反义核酸或miRNA抑制剂，可以抑制miRNA的活性。之后利用基因芯片分析mRNA的变化可找出相应miRNA的靶基因。

如今又兴起了一种新方法——降解组测序（Degradome Sequencing）。此技术将新一代高通量测序和生物信息学工具相结合，已成功应用于植物miRNA的靶基因筛选。使用降解组测序，许多以前证实和预测的miRNA靶基因得到了验证，表明该方法是一种高效的大规模鉴定植物miRNA靶基因的方案。

据联川生物介绍，降解组测序揭示miRNA靶基因是通过从整个转录组上鉴定小RNA介导的靶基因剪切片段（非帽子结构的5’片段）。将测序read与mRNA进行比对，由miRNA剪切产生的mRNA的5’末端碱基会与miRNA的第十位碱基互补。因此，在降解组测序read中，剪切产生的片段会在预测的剪切位点处出现明显的峰。候选的miRNA靶基因可以以t-plot图的形式呈现。降解组测序实验流程见下图。

联川生物现已推出降解组测序服务，可协助你高效快速地筛选出miRNA的靶基因。他们曾使用降解组测序技术并结合小RNA测序技术对铝胁迫下的野生大豆miRNA及其调控的靶基因展开研究，共鉴定出已知miRNA的86个靶基因和新发现miRNA的5个靶基因。索取资料>>

此外，一些研究人员也利用蛋白质组学的研究方法，从蛋白质水平去寻找miRNA的靶基因。他们利用SILAC或2D-DIGE技术来查看转染miRNA后蛋白表达水平的变化，其中许多变化在mRNA水平都不能体现。

免疫沉淀

当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。

目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。

Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。

整个过程大致如下：

1. 创建miRNA模拟物。
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。

Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。

靶基因的验证

预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。

目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。

目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。了解更多>>

就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。（生物通 余亮）