测序前核酸提取的不二选择[新品推荐]

【字体: 时间:2014年09月03日 来源:基因有限公司

编辑推荐:

  全基因组测序对DNA质量的要求非常高,不仅要求DNA的量要充足,DNA的纯度要高,而且DNA的完整性也非常重要。如果DNA完整性差的话,断裂的DNA片段不仅在抽取过程中容易降解,而且在测序后的结果分析时,也难以获得全面的信息。Kurabo 公司的QuickGene技术可以从全血、动植物组织和细胞菌液等中得到高质量的DNA,不仅得率高,纯度好,而且DNA更长,有利于测序实验得到理想的结果。

原理- Kurabo创新的专利超薄多孔滤膜

Kurabo QuickGene试剂盒采用独家专利的超薄多孔滤膜,超薄滤膜可在低压的条件下获得更长的核酸,避免离心力对核酸产生剪切,还可减少抽提的时间;多孔滤膜比表面积大,具有出色的核酸吸附和解吸附能力,避免蛋白及其他杂质的吸附,获得更多和更纯的核酸。

图1:创新的多孔滤膜扫描电镜拍摄结果
创新的亲水性多孔滤膜厚度仅80um,是玻璃纤维滤膜厚度的1/12.5,而表面积比玻璃纤维滤膜大20倍,无需高压即可完成样本纯化实验

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专利薄膜技术带来很多优点:

1.专利薄膜表面积大,核酸吸附力强,得率高;

图2:QuickGene方法与其他核酸提取方法得率比较
分别用QuickGene-810、硅胶膜法和磁珠法从200ul全血样本中提取基因组DNA,平均每组10个样本,QuickGene得到的DNA量为5.8ug,硅胶膜法为4.2ug,磁珠法为2.7ug。

2.专利薄膜具有亲水特征,亲水性的核酸易吸附,而疏水性的蛋白质和脂类很容易被洗脱出过滤膜,而且优化的洗脱液成分更接近纯水,得到的核酸纯度好;

图3:QuickGene从各种样本中得到高质量的核酸
分别从菌液中提取质粒DNA,从小鼠尾巴和肝组织中提取DNA,从小鼠肝脏、脾脏和心脏组织中提取RNA,用QuickGene提取的核酸在保证高得率的前提下,260/280均在1.8–2.0之间,260/230 均在 2.0–2.2之间。

3.专利薄膜滤膜厚度是传统硅胶膜的1/12.5,能正压法过柱,温和、剪切力小,DNA片段更长,完整性好;

图4:QuickGene抽提的核酸更长
因为QuickGene抽提使用的是正压方式洗脱,得到的DNA片段可达97kbp。而传统的硅胶膜法使用的是离心的方式进行洗脱,而离心力在洗脱过程会对DNA产生剪切,所以得到的DNA片段只在24.5kbp处富集。
M:Midrange PFG maker II;Q:QuickGene-610L;S:Spin Column
 
4.专利薄膜滤膜厚度超薄,不易堵柱子,能做粘稠血样如糖尿病,还能做血凝块;

图5:QuickGene和其他滤膜法抽提糖尿病人血样比较
糖尿病人血样由于含糖量高所以非常粘稠,用滤膜法进行粘稠样本核酸的提取是一个挑战。我们分别用QuickGene和其他品牌的滤膜法对47个糖尿病人血样进行核酸的抽提,QuickGene提取的核酸不仅在得率上远高于其他品牌,而且260/280和260/230 均在1.8–2.0 和 2.0–2.2之间。

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QuickGene抽取的核酸在NGS的优秀表现:

用Kurabo的试剂盒抽提的DNA有更高的纯度和更好的完整性。用QuickGene DNA whole blood kit S从全血中提取全基因组DNA,可直接用于下游二代测序(NGS)。我们将QuickGene抽提的DNA用于外显子序列的分析实验:

文库制备的试剂:Illumina Nextera Exome Enrichment kit
NGS仪器 :Illumina HiSeq2000
读取方法:100bp, 双末端法
数据量:大于8Gb / sample

DNA测序前质量的评估
用紫外和荧光分光光度计对DNA的得率和纯度进行分析,用电泳的方法对DNA长度进行检验:

纯度和得率

纯度

260/230

1.705

纯度

260/280

1.950

洗脱体积

μl

200

浓度

ng / μl

25.2

得率

μg

5.0

1:1kbPlusDNALadder
2:ExtractedDNA
3:λ/HindIIImarker

DNA文库构建:

DNA文库有足够的长度

外显子序列分析:

Items

Description

Number of base

1

Non-redundant reads

(de-duplicated by Picard tools)

Number of non-redundant reads

132,541,212

2

Non-redundant unique reads

(uniquely mapped to human genome)

Number of unique reads mapped in human genome

116,879,297

3

(2÷1)

% Non-redundant unique reads

(out of non-redundant reads)

Ratio of non-redundant unique reads to non-redundant reads% for non-redundant reads

88.2%

4

Target regions (bp)

Number of bases in target regions

62,085,286

5

Number of target genotypes

(more than 10X)

Bases covered more than 10x coverage

56,460,863

6

(5÷4)

% Coverage of target region

(more than 10X)

Percent bases covered more than 10x coverage

90.9%

7

Mean depth of target regions (X)

Average coverage of target regions

115.8

从表中我们可以看到,用QuickGene抽提的DNA进行二代测序得到的reads,有88.2%能与人类全基因组DNA匹配;有90.9%的reads在目的区域超过10X。

QuickGene技术为文库构建提供了一个快速且高重复性的平台,NGS的结果表明,用QuickGene抽提的DNA可以让NGS实验的可靠、可重复,有更长的DNA序列能贯穿目的区域。QuickGene试剂盒为NGS提供了一个高效和最佳的平台,能建立高产量、最低的序列偏离和更低错误率的DNA文库。

他们在测序前都用QuickGene-610L进行核酸的提取:

日本横浜市立大学科学家们研究发现,4位卵巢早衰(POF)的病人是因为染色体平衡易位引起的,并且他们还找到了X染色体的断点[1],在研究中,他们获取了4位POF病人的外周血白细胞,用QuickGene-610L提取全基因组DNA,再用于二代测序,得到比较好的结果。

日本筑波大学的科学家们最近的工作发现,MILR1启动子的多态性对基因表达水平和特异反应性表现的影响[2],他们用QuickGene-610L对1505个日本人的全血进行全基因组DNA的抽提,然后进行二代测序进行数据的分析,得到了比较好的数据结果。

法国居礼研究院的科学工作者们以乳腺癌基因BRCA1和BRCA2为模型,优化了以PGM为基础的Ion Torrent测序诊断[3]。他们从30个病人的全血中,用QuickGene-610L提取到全基因组DNA,然后用NanoDrop(Thermo Fischer Scientific)进行浓度的检测,按照操作手册将30个DNA样本调到50 ng/ul,再进行测序实验,成功地得到漂亮的数据,并且作者还在文章中强调了DNA的高质量对测序的重要。

法国居礼研究院的科学工作者们还发现用EMMA的方法同时进行点突变和大规模基因组重排的检测是一种耗时又费钱的诊断方法,于是他们进行改良,并用于1,525个病人的BRCA1和BRCA2基因的筛查[4]。各取病人2ml全血,同样用QuickGene-610L提取全基因组DNA,然后用NanoDrop测量DNA浓度和纯度,所有的DNA样本260/280和260/230 均在1.8–2.0 和 2.0–2.2之间,将DNA浓度调到50 ng/ul,再进行测序实验,得到理想的结果。

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参考文献:
[1] Akira Nishimura-Tadaki, TakahitoWada.Breakpoint determination of X;autosome balancedtranslocations in four patients with prematureovarian failure.Journal of Human Genetics (2011) 56, 156–160;
[2] KentaroNanatsue, Takahiro Ninomiya, Mio Tsuchiya. Influence of MILR1 promoter polymorphism onexpression levels and the phenotype of atopy.Journal of Human Genetics (2014), 1–4;
[3] Julien Tarabeux, Bruno Zeitouni,VirginieMoncoutier.Streamlined ion torrent PGM-based diagnostics:BRCA1 and BRCA2 genes as a model.European Journal of Human Genetics (2014) 22, 535–541;
[4] VirginieCaux-Moncoutier,Laurent Caste´ ra, Carole Tirapo,EMMA, a Cost- and Time-Effective Diagnostic Methodfor Simultaneous Detection of Point Mutations andLarge-Scale Genomic Rearrangements: Applicationto BRCA1 and BRCA2 in 1,525 Patients.Human Mutation(2011)

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