CyTOF：以单细胞的视角重新审视生命[新品推荐]

很容易想象Sean Bendall博士被列入全美“40 Under 40”名录（每年评选40个在各领域有突出表现的的年轻人）；他曾经在斯坦福Nolan实验室任助理教授，这个实验室位于美国Palo Alto小镇，隶属于加州蛋白质组研究中心的国家心肺和血液研究所（NHLBI）。Bendall不愧是一个年轻人的杰出代表，他的工作深深影响了其所从事的研究领域。当今，一场新兴的运动正在生物学界悄然兴起，一系列单细胞生物学的技术不断涌现，它们正在促使科学家以全新的视角重新审视一些传统的研究领域。而Bendall则正走在这场运动的前沿。

图一、Sean Bendall博士

Fluidigm公司的CyTOF实验系统，不但使原来复杂的工作流程得到了简化，同时也将单细胞研究提升到了一个新的水平。基于此，Bendall和他具有前瞻性思维的同事们已经获得了诸多新发现。他们的研究对象是人的免疫系统，相对于成熟的免疫系统，其发育的动态过程更加的复杂，他们正在利用CyTOF精细的揭示这一过程；这是CyTOF在新领域的应用，也为该领域提供了一个新的研究思路。

 
图二、质谱流式实验系统组成

在Nolan实验室中任职期间，Bendall和他的同事们将蛋白磷酸化流式技术与质谱流式技术结合起来。该实验室一直致力于流式细胞技术的改进和相关单细胞检测方法的开发，目前已经成为该领域的领导者。

通过将蛋白质组学和高级数据分析方法有机结合，这个实验室成功的对在正常和病变细胞信号通路进行了研究，这种研究方法是革命性的。Bendall从他在Nolan实验室的这段时间中获取了很多灵感，并把这些灵感用于自己的新实验室中。目前，两个实验室仍然密切合作，并共享着他们的CyTOF系统。目前，Bendall的实验室隶属于斯坦福大学病理系，位于斯坦福血液中心，在这里他重点研究人类造血和免疫系统，以及在健康或者病理（癌变，过敏和自身免疫性疾病）条件下的信号调控机制。

 
图三、利用CyTOF对骨髓的信号通路分析（SPADE分析）

于此同时，NHLBI和斯坦福的跨学科合作也正在进行中，他们已经在肺动脉高压（PAH）和自身免疫性疾病等领域开展了四个研究项目。他们的合作正好顺应了基因组学和蛋白质组学日益融合的大趋势。Bendall解释说，基因组数据具有很宽的覆盖面，而单细胞蛋白质组学的数据则是在单细胞水平上测量有限的参数。在Bendall本人的工作中，首先利用组学开启广阔的思路，再一步步缩小他的假设。“我不假装自己是一个单细胞分子生物学专家，”接着，他提起了一个在人过敏反应领域的合作伙伴Steve Galli，他可以算得上该领域思想领袖，现任斯坦福大学病理系主任，是研究过敏反应和过敏性免疫细胞功能方面的专家。

然而，Bendall是一个单细胞蛋白质组学和流式分析技术方面的专家。从理论上讲，他可以在他的实验室进行流式细胞分析，然后将样本带到校园另一边，将它们放到另一个实验室的检测系统中进行检测。所以，他有可能很快就可以沟通大学广场两边的世界。

看到知识共享的光明前景，同时又拥有实现它的手段，这令一直热爱技术的Bendall非常兴奋。通过多年来系统的科研训练，他已经成为了一个研究蛋白的生物化学家。他本科的学习一开始专注于生物化学和微生物学领域，随后逐渐转到蛋白质化学、蛋白质组学和质谱领域。后来，他曾在一个蛋白质组学实验室工作，与另一个实验室合作研究人类造血和胚胎干细胞。

研究中Bendall注意到，蛋白质组学可以分析上千万个细胞的总体状况；而干细胞研究则需了解单个细胞的功能；这似乎是一个悖论。

“当真正的根本问题在于单细胞的功能时，对大量细胞进行总体分析是很难奏效的。” Bendall回忆道。

这需要大量的后续工作，因为只有感兴趣的细胞正好是大多数时，对于总体的分析才是有效的。正是这种“技术上的障碍”让Bendall来到了斯坦福，他来寻找一种解决此类问题的工具——那就是基于单细胞检测的质谱流式技术。

 
图四、单细胞检测的必要性：总体数据会掩盖细胞多样性

Bendall面临的一大挑战就是做人类的研究。在以人为研究对象时，所能动用的手段更加有限——因为做为研究对象的人更不容易干预。“我们不可能弄一个笼子，把我们研究的人都养在里面。”Bendall笑道。我们可以敲除小鼠的一个基因，然后和了另一个带有该基因的小鼠进行对比。但是当研究对象是人类时，我们往往必须在没有干预的系统中比较不同细胞。Bendall利用单细胞分析来消除这种复杂性。其目标是创建一套技术，阐明人体内药物作用和基因功能。

 
图五、人为研究对象的挑战在于：其所能动用的技术手段更加有限

为了实现这一目标，Bendall正在重新设想其实验策略，将单细胞分析应用于到相关的研究中。通常来讲，在不同的平台上检测相同的样本可以产生类似的数据，所以Bendall首先利用单细胞蛋白质组学分析样本，然后使用另一个平台进行更深入的研究。

“分化的干细胞——特别是在培养皿里时——是混杂着的一群细胞，”他说。逐个测量这些细胞有助于弄清群体存在的异质性，并将它们分门别类，这有助于Bendall将注意力集中于特定的细胞种类，防止实验结果受到生物本身多态性的影响。

目前Bendall’s实验室有几个项目正在开展中，其中第一个是利用单细胞蛋白质组学研究人体过敏性粒细胞群体。一方面，他正在观察病人体内与常规过敏性反应相关的细胞。另一方面，他正在将基本生物学研究与人胚胎干细胞研究结合。胚胎干细胞可以进行基因操作，因此可以借此研究不同调节蛋白的功能。

尽管科学界几十年前就知道了这些类型的细胞，Bendall解释说，“我们还没有真正理解所谓‘异质性’的正常水平是什么样，以及在过敏性疾病病例中它们是怎样变化的。”他的研究也有可能应用于斯坦福正在组织的过敏免疫治疗临床试验中。简单的说，Bendall的研究重点是“理解正常我们就可以理解异常。”

有时，正常是一开始就被忽视的。当初Bendall来到诺兰实验室的时候，很多人在研究白血病。当他们研究癌变的骨髓样本时，Bendall也在利用CyTOF研究急性髓系白血病。他的第一个问题是简单明了：“健康的骨髓是什么样子的？”但是实验室并没有健康的骨髓样本，所以Bendall建议他们就从那里开始。因为病理学评分的基础就是“它离正常有多远”，对正常组织进行定量分析对于了解和预测组织异常至关重要。

 
图六、利用CyTOF对正常人和AML病人骨髓的对比图谱（分析方法：viSNE）

Bendall的第二个正在申请的项目，旨在探索单细胞技术如何应用于血液学研究。多年来对人类造血系统的免疫学研究一直是研究的热点，因为它与骨髓移植密切相关。在已有发现的基础上，Bendall希望通过对比移植成功以及出问题的病例骨髓内发生的事件，来了解骨髓植入综合症发生的精细机制。所以他打算利用单细胞技术对其机制进行精细分析。

“我们不要仅仅基于细胞表面Marker来厘清样品的组成”Bendall说。“我们还可以利用胞内的起调节作用的生化分子，正是它们影响了细胞的行为。”他的研究可能成为一项可行的临床方法。例如，根据他的研究成果，如果一个人有太多的一种细胞类型而另一种却不够，治疗方案就可能按照该病人的情况进行精细的调整，实现个体化治疗。

Bendall的工作还可能有助于重新定义科学家如何设计实验。“传统流式研究往往具有强烈的‘假设驱动’色彩，”他说。“它们往往是一些‘是或否’的问题，或者是一个清单。” 但是，当你不知道在寻找什么的时候该怎么办呢？

在Bendall 2014年四月发表在Cell上的文章中，他在正常人骨髓中发现了B细胞前体的几个新的组分，这在此前是没有报道过的。一群被称为“组分三”的B细胞，起到了“看门人”的角色，决定了B细胞的成熟并做为一个“检查站”防止自身免疫的发生。这是一个重大发现：

“这些细胞在骨髓中比率约为万分之一，”Bendall解释道，“所以，除非你清楚地知道细胞的特征是什么，否则你没有办法随机的找到它们。”

 
图七、2014年Bendall在《cell》中报道了一个新的B细胞前体亚群（Population 3）

CyTOF数据能帮助其找出正确的细胞群，这使Bendall能够进一步进行基因组分析，以此证明B细胞的基因组重排是随着细胞发育过程而增加的。这不仅仅是一个发现——它成了一个全新的策略。它给了Bendall一个新的工作流程，这就是以这种分阶段的方法将基因组学和蛋白质组学结合起来，并在最后清晰的提炼出他的结论。

“在一个细胞群体中，也许1/3细胞的2/3是最有趣的，”Bendall提到。“我不知道怎样区分这些细胞，但现在我有一个基本的概念，我可以预先提纯，使它们进入下一个实验，在下面的步骤中可以采用诸如基因表达等其他指标更深入的挖掘细胞内的信息。这是不同技术的结合，真正实现 “连续攻击”。

首先，Bendall 利用CyTOF发现了一个新细胞群体，然后进行mRNA测序去寻找其独特的表面Marker。根据这些表面Marker，就可以利用传统流式富集特殊细胞群体。通过刺激物或药物处理细胞，最后通过基因测序或质谱流式来深入研究其生物学效应。

 
图八、新的研究策略：质谱流式与常规流式、DNA检测等常规手段的有机结合

单细胞技术和CyTOF实验系统都处于这种分阶段研究策略的前沿，它使科学家们能够“处理小数量的样本同时，可以提出许多许多问题，”他说。在某种程度上，Bendall和他的同事第一次走在一条返朴归真的道路上。细胞是生命的基本单元，当你逐个去观察它们时，就可以明白更多。

了解Fluidigm公司CyTOF系统的详细信息

延伸阅读：
Single-Cell Trajectory Detection Uncovers Progression and Regulatory Coordination in Human B Cell Development
http://s.oatos.com/f07358?locale=zh_CN