哪些因素影响纳米孔测序仪的重复性?

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年10月19日 来源:生物通

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  掌上测序仪好不好?用过才知道。最近,五个试用了Oxford Nanopore MinION测序仪的实验室评估了仪器的重复性,并在开发标准操作和参考数据。这些实验室属于MinION分析和参考联盟(MARC),该联盟由MinION早期试用计划的参与者组成。

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生物通报道 掌上测序仪好不好?用过才知道。最近,五个试用了Oxford Nanopore MinION测序仪的实验室评估了仪器的重复性,并在开发标准操作和参考数据。这些实验室属于MinION分析和参考联盟(MARC),该联盟由MinION早期试用计划的参与者组成。目前,第一阶段的结果已经发表在开放获取期刊F1000Research上。

当Oxford Nanopore发表第二个版本的流动槽时,“无疑每个小组获得了不同程度的成功,”作者写道,个中原因很难从单次测序运行中判断。因此他们计划在几个地方重复实验,评估MinION的产量、准确性和重复性,并找出哪些技术因素决定了高性能。

在这项研究中,英国、美国、加拿大和荷兰的五个实验室利用MinION来产生大肠杆菌K-12同一菌株的序列数据。他们采用相同的操作来培养细菌、提取DNA、制备测序文库并测序。由于研究期间Oxford Nanopore发布了新的测序试剂盒,故实验室也生成了第二个数据集,在整个研究中总共开展了20次运行。所有实验在三月底到四月底期间开展。

总的来说,研究人员发现流动槽的质量有“相当大的差异”,不过所有流动槽在送达实验室时都有大量活性的孔,能产生产量、质量和准确性相当的数据。

利用R7.3流动槽和SQK-MAP005试剂,典型的实验可产生2万条2D序列,平均读长在6.5 kb,产生约115 Mb的数据。在使用8 kb的剪切操作时,大约5%的2D序列至少是10 kb,有些甚至超过50 kb。单个2D碱基检出的总错误率是12%,包括3%的错误检出、4%的插入和5%的缺失。单次运行产生了覆盖大肠杆菌基因组达25倍的碱基。

研究人员发现,不同运行之间数据的数量和质量发生变化的一个原因是,标准操作中的许多步骤都对材料和试剂的质量很敏感。此外,研究人员偶尔不按步骤操作,或计算机发生故障也会影响数据。“MinION数据质量变化在很大程度上取决于实验室特有的行为,”作者写道,不过方法变化和计算机故障的影响很小。

研究人员认为,MinION设备本身的性能是一致的,没有因设备问题而导致实验失败。他们也没有观察到任何GC偏向,但同时指出,通过大肠杆菌基因组可能难以检测。总的来说,目前有多种方法可改善MinION的性能,包括更清晰的操作步骤、更长文库分子的方法以及更好的运行脚本。

这个联盟打算利用MinIon Mk1设备和试剂开展更多的实验,看看这是否会带来数据产量、准确性和错误图谱的变化。未来,他们计划进入实验的第二个阶段,发现那些能够改善平台性能并扩展潜在应用的操作变化。

原文检索

Ip CLC, Loose M, Tyson JR et al. MinION Analysis and Reference Consortium: Phase 1 data release and analysis [version 1; referees: awaiting peer review] F1000Research 2015, 4:1075 (doi: 10.12688/f1000research.7201.1)

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