科学聚焦:恶性血液病中的拷贝数畸变[创新技巧]

【字体: 时间:2015年10月09日 来源:Affymetrix

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  利用SNP芯片技术的拷贝数分析,如CytoScan HD,正在酝酿着一次对恶性血液病的诊断、预后和疗法预测的变革。Fred Hutchinson癌症研究中心的成员、华盛顿大学细胞遗传学和基因组学系的主任Min Fang教授,正是引领着血癌分子鉴定向更有效、更经济的流程转变的科学家中的一员。

简介:利用SNP芯片技术的拷贝数分析,如CytoScan HD,正在酝酿着一次对恶性血液病的诊断、预后和疗法预测的变革。Fred Hutchinson癌症研究中心的成员、华盛顿大学细胞遗传学和基因组学系的主任Min Fang教授,正是引领着血癌分子鉴定向更有效、更经济的流程转变的科学家中的一员。

1. 作为一位医生/研究人员,您如何将发现生物标志物的研究兴趣融入到患者治疗中?

站在医生的角度,我知道就患者的诊断和治疗而言,哪些在临床上是真正有用并且重要的。我有机会与其他专家合作,如肿瘤学家和临床遗传学家,特别是我周围的肿瘤学家,这样我就能了解他们的许多观点;特别是疾病领域的专家,他们对疾病了如指掌。同时,由于我处在临床和诊断实验室的环境中,我能够在很短的时间内,相对较快地将大量的研究成果转化成临床实践。

我所在的中心经常参与临床研究。几乎70%的患者参与了临床试验。我们有一个非常完善的系统,整合了患者的知情同意过程:生物标本库的全体共识,以及在患者就医时提供的个体流程知情同意书。无论我们研究哪种类型的问题,我们都尽量减少知情同意书的数量。我们确保最大限度降低患者的风险,并尽可能增加患者的好处,并解释,有时这些好处可能属于未来的患者。

2. 您能介绍一下Fred Hutchinson如何对血液肿瘤的样本进行诊断检查吗?如何将CytoScan HD融入您的流程?

Fred Hutchinson在恶性血液病的治疗和研究方面很有名,最近几年,我们扩大了关注目标,加入了实体瘤的检查、试验和治疗。我们有许多血液肿瘤的患者,将其分成两组:

1. 常规肿瘤:有些患者过来做初步的诊断和治疗(主要是化疗)。检查包括诊断。我们最近开发出作为治疗标准的Pathway系统。Pathway诊断系统依托整合为一体的流式细胞术、病理学、形态学评估、细胞遗传学和分子检测的组合。我们尝试以最少的检测来获得最多的信息以实现诊断和预后。CytoScan HD融入流程的一个例子是:如果患者被怀疑患上了急性白血病,但不清楚谱系的话,第一步将采用流式细胞术,以确定它是淋巴还是骨髓的疾病(ALL还是AML)。在这之后,如果是AML,我们折回到STAT核型分析 – 我们能在48小时内获得核型分析结果。与此同时,我们开展平衡易位的FISH分析,因为AML有多种平衡易位可能引起这种疾病。我们将检测常见的相关易位,如inv(16)、t(8;21)、t(15;17),因为它们都与治疗相关。如果核型和FISH结果都是正常的,我们自动折回到CytoScan HD,作为染色体基因组阵列分型(CGAT)的主要平台。CGAT是核型分析和FISH后的检测。通常我们能看到患者是否有拷贝数增加和减少、杂合性缺失,及其他基因组异常。我们还开展单个基因突变的检测,如FLT3、NPM1和CEBPA,这些都是常见的基于PCR的体细胞突变检测。
2. 移植诊所(Fred Hutchinson是骨髓移植的摇篮)。移植诊所是我们中心的独特优势。这些患者之前在我们中心或其他地方进行过治疗。在理想的情况下,他们已经完全缓解,需要接受移植,以便长期生存和治愈。我们的Pathway系统也有这些患者移植前后的标准治疗方法,以监控移植效果。

3. 您是否希望WHO的指南中加入“拷贝中性的LOH作为恶性血液病的分类方法”?

我们正在努力提倡通过染色体基因组阵列分型(CGAT)来鉴定拷贝中性的杂合性缺失(cnLOH)的作用,且最近在《Cancer》期刊上评论了cnLOH的临床应用。目前,WHO、NCCN和ELN的指南中都没有包含cnLOH,作为诊断或预后的分类工具。然而,有证据表明,cnLOH是一个非常重要的分类工具,故我们主张将其用于AML的诊断和治疗。随着证据越来越多,我们希望国际指南将cnLOH的评估融入诊断和预后流程中。

4. 新的分子检测方法的临床验证

CGC 2015上有一个关于临床验证的会议。每个人的做法都略有不同。这取决于技术通用性和实验室主任的舒适度。对于那些拥有丰富的平台技术经验来解释结果的主任而言,这比较容易 – 对于这一部分,验证将不那么广泛。一般情况下,目前已经有了指南:ACMG、AMP都有芯片检测的通用指南。肿瘤学则涉及到更多的验证,因为我们不能在100%的细胞中观察到异常。我们需要考虑肿瘤负荷,有时只有20-30%或更少。所以就有检测低水平嵌合的问题,特别是在分子检测中。因此,对于癌症,我们需要考虑以下几方面的验证:

1. 验证组中由样本类型造成的预分析影响(Pre-analytical effects):例如新鲜或冷冻的组织、FFPE、细胞遗传学细胞沉淀、细针穿刺(FNA)、CSF、血液、骨髓等。
2. 足够数量的正常和异常样本,以便容忍特定平台的假象。这将有助于为cnLOH、拷贝数变异和拷贝数异常等建立适当的假阳性划分范围。
3. 分析灵敏度/特异性:重要的是建立检测极限,而精确定量是次重的指标。
4. 临床有效性 – 与现行标准(细胞遗传学或FISH)进行比较,以便验证此平台对检出率的改进提高程度有多大。需要建立参考范围和检测性能的特征参数。

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5. 哪一种技术平台最适合开展细胞遗传学分析以便进行恶性血液病的诊断、预后和疗法预测?有哪些特征?

没有一种平台是万能的。CytoScan HD在检测和覆盖上很棒,且整个基因组的分辨率都很高。CytoScan HD的检测极限(~20%)使其适用于诊断或复发的情况,它们有足够的疾病负荷。在微小残留病灶的情况下,如果你先富集了异常的细胞群体,CytoScan HD也很有用(对多发性骨髓瘤,我们就是这么做的)。在传统的细胞遗传学中(G带分析),你的分辨率非常低,会丢失小的拷贝数异常和隐秘的易位。尽管FISH在这些方面挺有用,但FISH的问题在于你必须知道你要找的准确位置。阴性的FISH结果并不意味着正常的情况,因为它不是全基因组的分析。靶向的NGS panels也是如此 – 因为并非整个基因组被覆盖,即使是阴性的结果,患者仍有可能带有异常。因此,没有一个平台是放之四海而皆准的 – 我们需要技术的组合,若以明智的方式使用,它们将最大限度提高信息产量和成本效益。

6. 请您评论一下恶性血液病和实体瘤中的拷贝数意义的演变。

我确实看到了实体瘤中拷贝数分析的作用。过去人们不查看拷贝数的唯一原因是没有强大的技术。恶性血液病在应用细胞遗传学上如此广泛深入的原因是在于外周血和骨髓非常适合体外培养。在基因组芯片出现之前,传统的细胞遗传学(G带分析)是唯一的全基因组工具。全基因组测序还没有准备好在临床上的应用。因此全基因组(分析)的能力将让人们看到恶性血液病和实体瘤中的拷贝数畸变。过去,利用G带分析的细胞遗传学和传统的培养技术无法产生太多结果 – 任何实体瘤的培养过去是,现在仍是研究课题。不过,随着新技术(OncoScan FFPE Assay Kit)的出现,我们能够在全基因组水平上评估实体瘤中的拷贝数畸变,甚至FFPE组织中的拷贝数畸变。我们为在全基因组水平上关联畸变的临床意义打开了机会。人们开始认识到实体瘤中的拷贝数畸变的价值,比如乳腺癌。对于肾细胞癌,拷贝数畸变比单点突变更为普遍,也更具有临床相关性。

7. 您通过CytoScan HD检测到的哪些分子特征能帮助您进行患者管理?

除了前面提到的拷贝数增加和减少以及cnLOH,你还可以通过易位断点上一些小的增加或缺失的检测来推断平衡重排。我们已经检测到隐秘的易位,比如通过NUP98-NSD1融合来检测AML中的t(5;11),这你无法通过G带分析细胞遗传学来发现,通常也不会进行RT-PCR或FISH检测,因为它们太罕见了。不过,我们利用CytoScan HD看到了这样的病例,在易位断点有小的增加和缺失 – 我们据此推断为易位。t(5;11)是那种与预后不良相关的易位。通过其他所有标准,患者都被诊断为正常:G带分析和常规FISH检测将产生阴性的结果,而患者将被归为中等风险的AML。随着这些新特征的鉴定,患者将被重新归为预后不良和高风险,并且需要考虑移植。此外,CytoScan也能检测基因扩增,这有望指导治疗。在特定的位点表现出拷贝数扩增的患者,如PDGF α和β,可考虑用酪氨酸激酶抑制剂来治疗。此外,如果你通过纵向研究一直追踪患者,你会检测到其他与疾病发展进程相关的克隆进化事件的发展。有时,这种克隆进化的发展将早于疾病发展的临床表现,它提供了一个早期预警,说明患者的疾病可能正在发展,从而引发更积极的患者管理。值得注意的是,cnLOH的检测是一个特征,仅有染色体基因组阵列分型(CGAT))能在常规实践中检测(通过CytoScan、OncoScan或其他含有SNP的芯片平台。

8. FISH和CytoScan HD都属于恶性血液病的预后分析,但它们有哪些关键的差异?

CytoScan HD上检测到的拷贝数异常与FISH可检测到的相当。就分析拷贝数增加和缺失而言,CytoScan HD检测的灵敏度基本上达到100%。对于慢性淋巴细胞白血病等疾病,它们主要是由拷贝数畸变引起的,FISH可替换成CytoScan HD。这将节省经费,而你也能了解更多的位点,获取更多的信息。我们正在努力推动Fred Hutchinson的这一转变。不过,修改以用FISH作为患者登记的合格标准的旧操作是一个渐进的过程,有必要影响一些临床应用的操作编写者和审核者,在某些适应症时使用CytoScan HD来代替FISH。

9. 您在CytoScan HD平台的数据分析上有哪些经验?

此平台上的数据分析非常简单、方便,并且可靠。当然,这取决于数据质量。如果你保证了所有的预分析参数和分析QC,那么结果很容易读取。ChAS和Nexus的数据分析软件带来很大帮助。它们满足了我们的需求,让我们在使用软件输出时能够非常自信地撰写临床报告。ChAS在等位基因追踪特征上尤为擅长 – 它明确且灵敏,让人们能够清楚地看到镶嵌缺失、增加和等位基因不平衡。Nexus则擅于检测低水平的增加和缺失,并带来良好的全基因组视图。从研究的角度来看,客户在.bed文件中输入他们自己的基因tack的能力是非常有用的,让我们能放大与特定研究问题有关的感兴趣的特征。外链到DGV、NCBI促进了那些基因区域的深度研究。分析平台在我们的研究和发表上发挥了重要的作用。ChAS的另一个非常有用的特征能够在单一视图中比对多个样品。这有助于纵向研究中差异的比较。

CytoScan HD和OncoScan FFPE Assay Kit仅供研究使用。不可用于诊断。

(本文由Affymetrix供稿,生物通翻译)

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