新一代测序十年记：后起之秀PacBio

在新一代测序技术崛起的早期，市场主要被Illumina、Life Tech和Roche这三家公司占领。偶尔也有一些新的测序平台出现，但大多是雷声大雨点小，不久便没了下文。面对这些强大、成熟的系统，新平台要想站稳脚跟，的确不是件容易的事。

在2010年的AGBT年会上，Pacific Biosciences的测序仪吸引了众人的注意。这台名为PacBio RS的测序仪被称为第三代测序平台，而有别于之前推出的二代测序平台。至于什么是第三代测序，PacBio当时的CEO Hugh Martin是这样解释的，“它就是在第二代测序（通量、成本）的基础上添加非常长的读长、极低的试剂成本，以及快速的运行时间”。

的确，PacBio RS系统有着其他系统无可比拟的读长，超过1000个碱基。这是因为PacBio的单分子实时（SMRT）测序反应是最接近天然状态的聚合酶反应体系，最大限度地保持了聚合酶的活性。此外，样品制备非常快速，只需要4-6小时，而不是几天。制备过程不需要PCR，从而减少了错误和偏向。从样本制备到测序，所需的时间还不到一天。

对于重测序而言，短读长也许不是大问题，但是对于de novo测序，这可让人们吃尽苦头。例如，韩国极地研究所的Hyun Park在测序一种GC含量高达71%的极地微生物时发现，即使利用Illumina平台进行200X深度测序，仍无法获得完整的基因组图。组装时产生了185 个Contig，而且缺口数量太多，根本无法通过Sanger法有效补齐。他们只好求助于PacBio，而后仅用15X覆盖度就能组装得到26个Contig，最终获得了完整的基因组信息。

随后，《Nature Methods》上发表的一篇文章又再次让PacBio成为关注的焦点。研究人员利用SMRT技术，直接测定了DNA的甲基化，这是二代测序技术无法实现的，因为它们在测序前需要PCR扩增，一扩增这些修饰标记就被置换而消失殆尽了。SMRT技术利用DNA聚合酶的动力学特征，对碱基掺入时产生的停顿间隔脉冲信号足够敏感，可区分12种以上不同类型的碱基修饰。这些信息也帮助解析了欧洲大肠杆菌疫情的元凶E. coli O104:H4。

然而，PacBio也受到高错误率的困扰。人们一听到85-87%的原始准确性就吓坏了。虽然PacBio也澄清，这是由于在测序过程中单个分子信号弱，偶尔会出现信号难于分辨的情况。出错几率是随机的，与序列长度、序列组成无关。只要提高循环次数，就能够提高准确率。不过，PacBio的业务还是一度陷入低迷，股价在1块多徘徊。

2012年，事情开始出现转机。冷泉港实验室的Michael Schatz开发了一种纠错算法，用二代测序的短读长高精确数据对三代长读长数据进行纠错，这种称为“混合纠错拼接”的算法发表在7月的《Nature Biotechnology》上。通过混合纠错法，他们发现“数据几近完美”。

这种方法融合了二代测序和三代测序的优势。“对于短读长，哪怕无限制地提高覆盖度，也不能解决复杂区域的测序问题。但长读长可以跨越这次复杂区域，因此不需要太高的覆盖度就可以对付。同理，长读长也可以用于检测并鉴定单倍体型和转录本的可变剪切，”Schatz谈道。

第二年，PacBio发布了新版本的测序仪 – PacBio RS II，平均读长达5,000 bp，最长读长超过20,000 bp，且通量较之前的版本增加一倍。随着硬件和软件的不断升级，订单数量也开始增加。到2013年底，PacBio更与Roche合作，联手打造一款临床测序产品。此后，引用PacBio系统的研究成果不断在各种刊物上发表。

Illumina超高通量测序平台HiSeq X Ten的上市也为PacBio带来了新订单。韩国公司Macrogen和J. Craig Venter的Human Longevity在安装了HiSeq X Ten系统之后都购买了两台PacBio RS II系统。他们在开展大规模人类基因组测序研究时，希望利用PacBio的长读长来弄清结构变异及其他复杂区域。

至此，PacBio完成了一次漂亮的逆袭。它凭借自身的独特优势，在竞争激烈的新一代测序市场上站稳脚跟，并带来丰硕的研究成果。当然，仪器仍在不断升级。最新型号的Sequel测序仪将在明年上市。（生物通 余亮）

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