辞旧迎新,ChIP都有哪些新玩法

【字体: 时间:2015年12月31日 来源:生物通

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  染色质免疫共沉淀ChIP的基础理念多年来并没有太大的改变,但开发者们一直在不断进行着优化。在辞旧迎新之际,让我们看看ChIP领域都有哪些值得期待的新东西。

生物通报道:如果研究者们想知道蛋白在做什么,他们通常会采取直接的方式:免疫共沉淀能知道蛋白A和蛋白B有没有在一起,ChIP能确定蛋白A是否与核酸序列B结合。

染色质免疫共沉淀ChIP可以鉴定与指定蛋白结合的DNA序列,其基础理念能追溯到几十年前。如今ChIP已经成为了表观基因组学的一个基本工具,与新一代测序联合使用可以实现基因组调控区域的定位和图谱分析。

过去人们倾向于将大部分精力放在蛋白编码区域,斯坦福大学医学院的Michael Snyder教授说。“很明显调控区域也是非常重要的。ChIP差不多是找出这些调控区域的最佳途径。”

ChIP实验主要是通过交联把蛋白质-DNA互作固定下来,破碎细胞并释放其中的染色质。随后将DNA打碎成小片段,用针对靶蛋白的抗体捕获我们想要的DNA。最后去除交联复原DNA,再通过PCRDNA芯片或测序进行检测。

ChIP的基础理念多年来并没有太大的改变,但开发者们一直在不断进行着优化。在辞旧迎新之际,让我们看看ChIP领域都有哪些值得期待的新东西。(延伸阅读:成功ChIP的三大秘诀

处理低量细胞

传统ChIP往往需要使用大量的细胞,一百万甚至更多。对于成天与临床样本打交道的研究者而言,FACS分选细胞和FFPE细胞很难达到这样的要求。

在这种情况下,Active Motif公司的ChIP-IT® High Sensitivity kit就是一个不错的选择。从产品资料上看,这种试剂盒适合处理低量细胞(1000个细胞)或低丰度蛋白(50,000个细胞),尤其是一些稀有转录因子。“这是目前我们最畅销的产品之一,”该公司的产品经理Kyle Hondorp说。

                                                    立即索取ChIP-IT® High Sensitivity kit的最新信息

如果你想要对这样获得的DNA进行测序,可以试一试Kapa Biosystems公司的KAPA Hyper Prep Kit。这种试剂盒能用ChIP生成的低量DNA100 pg)构建测序文库,Kapa公司的支持和应用经理Adriana Geldart介绍道。

最近Active Motif公司还发布了低量细胞的ChIP-Seq技术服务,你只需要提供一万个细胞,就能将相关工作丢给他们去做。

固态ChIP

传统ChIP通过偶联蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微珠,来沉淀抗体-染色质复合物。Chromatrap公司将这个过程改造成一种基于过滤器的新方法。

Chromatrap分析用蛋白A或蛋白G包被的多孔过滤器取代微珠,省去了许多ChIP相关的传统液体处理步骤。“它基本上是一种固态ChIP分析,”Chromatrap公司的Stephen Knight指出。

这种方式可以显著减少洗脱和移液步骤中的样本损失,“我们加样之后,样品就留在基质中,”产品开发经理Amy Beynon说,“洗脱只需30秒,而微珠需要五分钟。”当然,这也大大缩短了ChIP所需的时间。

 


Chromatrap分析产品具有多种不同的规格,比如离心柱、96孔板、为下游qPCR或测序优化的试剂盒。另外,你还可以选择超声或是酶消化。“我们目前有36种试剂盒,”Knight说,这一数字正在持续增加,2016年第一季度将达到50种。

该公司逐步在一月份发布native Chromatrap试剂盒(即非交联试剂盒)。之后不久,他们还会发布一个针对FFPE样本的试剂盒。

反向ChIP

ChIP可以用来鉴定与指定蛋白相互作用的基因组区域。如果我们想要知道某个基因组片段的相关蛋白该怎么办呢?2013年大阪大学的Hodaka Fujii发表了一个这样的方法,并将其命名为enChIPengineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation)。

enChIP使用催化失活的CRISPR/Cas9系统和自定义的引导RNA,来特异性捕获指定基因组片段上的大分子(包括蛋白、RNADNA)。enChIP抗体靶标的不是特定蛋白,而是Cas9附带的多肽标签。

研究者们可以通过这种方式,鉴定与目的DNA相关的任何蛋白、RNA或其他DNAHondorp介绍道。(Active Motif正在将这种方法商业化,并计划在2016年上半年推出。)

“传统ChIP是靶标特定蛋白,鉴定它所在的基因组位点,” Hondorp解释道。“enChIP是反向的,靶标基因组区域然后鉴定谁结合在那里。”这种试剂盒可以检测染色质成环(与Hi-C类似),或者在CRISPR/Cas9研究中分析引导RNA的脱靶情况。

ChIP抗体

市面上的ChIP试剂盒种类繁多,但你可能并不真的需要它们,Novus Biologicals公司的产品经理Paul Spear说。ChIP经验丰富的实验室往往使用自制试剂,比如Snyder教授的实验室。该实验室在承担ENCODE项目的时候,使用了数百种ChIP抗体。“这种情况真的没必要购买试剂盒,”Snyder说。

从本质上看,ChIP实验中只有一个试剂是至关重要的,“最重要的还是抗体怎么样,” Snyder指出。

没有哪一种抗体适合所有的实验,因此供应商一般会标明抗体是否做过ChIP验证。Abcam公司提供有大约六百种ChIP验证抗体,Novus Biologicals公司拥有大约四百种,而Chromatrap公司最近也发布了自己的第一批抗体(九种)。

虽然许多公司都在不遗余力地测试自己的抗体,但自己验证一下抗体是比较明智的,Snyder说。2012年他和同事列出了ENCODE modENCODE项目的抗体使用指南,详细说明了转录因子和组蛋白修饰抗体的验证方法。在他们测试的抗体中,“只有四分之一或五分之一”适合ChIP。专家给出的建议是,新抗体买来之后应该用供应商推荐的步骤和对照进行测试。

参考文献

 [1] Fujita, T, Fujii, H, “Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR,” Biochem Biophys Res Comm, 439, 132-6, 2013. [PMID: 23942116]

[2] Landt, SG, et al., “ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia,” Genome Res, 22:1813-31, 2012. [PMID: 22955991]

Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译)

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