蛋白生产的放大，可不仅仅是增加培养瓶[心得点评]

放大蛋白生产可不仅仅是将细胞培养瓶的数量增加一倍。无论你是打算将你的基础研究提升一个档次，还是准备开展动物研究或I期临床试验，你都需要更加严肃认真地对待蛋白生产。

随着项目越来越大，高效利用时间和经费就显得更加重要。选择最有效的方式来进行这一切，从细胞培养到收集和纯化终产物，绝对物有所值。那么，现在就让我们与“马马虎虎”告别，拥抱优化的蛋白生产吧。

贴壁细胞

Fred Schendel领导了明尼苏达大学生物技术资源中心（BRC）的大规模蛋白纯化工作。他认为：“在研究中，一切都在变小、变小。新技术的出现，让你不再需要大量蛋白去做基础研究。”Schendel表示，由于成本高，需求低，BRC已经淘汰了哺乳动物细胞培养的设备。不过，对于那些需要几百毫克蛋白的实验室而言，还是有很多方法能提高产量。比如，Schendel建议的外包。

那么，在实验室中你该如何放大？许多实验室习惯使用多孔板、培养皿和培养瓶来培养贴壁细胞。换成更大的容器似乎很简单，或者尝试一下多层细胞培养瓶（比如赛默飞世尔的Nunc™ TripleFlasks三层培养瓶、默克密理博的Millicell® HY多层培养皿，和康宁的HYPERFlask），或者将它们相互连接和堆叠（如赛默飞世尔的Nunc Cell Factory™和康宁的CELLStack）。

有时，对蛋白的需求可能超出了实验室的能力。那么，一种选择就是购买更多的培养箱，或扩展到滚瓶或其他系统，当然这需要投入资金和人员。在Sanford-Burnham医学研究所，“他们大多数时间都尝试悬浮培养，因为这更容易放大，”主管Darrin Kuystermans谈道。有时，这也意味着他们要改造细胞系来生产感兴趣的蛋白。不得已，他们也会使用微载体，通过悬浮培养的方式来培养贴壁细胞。

内还是外？

另一种促进蛋白生产的方式是让蛋白分泌到培养基中，这样下游处理就没那么困难。“我们只需要从培养基中纯化它，而不需要裂解细胞，并在蛋白纯化的过程中处理其他所有蛋白，”Kuystermans解释道。

偶尔，细胞也没那么听话。即使有了信号肽，它也不分泌蛋白。在这种情况下，Kuystermans可能改造纯化标签，以便更容易地从细胞裂解液中捕获蛋白。

Kuystermans建议先在小的摇瓶系统中检验，而不是一开始就采用较大规模的系统。搅拌引入了额外的氧气，会引起剪切并形成其他压力，这可能导致细胞开始结块，或不再生长。对于那些有疑问的细胞或蛋白，你可以试试瞬时转染，而不要花几个月的时间来筛选稳定的细胞株，然后才发现系统有问题。

不断优化

当你知道表达系统没问题时，下一步就是优化表达条件。最重要的培养参数包括温度、溶氧（DO）、pH和葡萄糖，这些可利用探头和传感器来监控，通过手动或自动控制。一种优化方式是利用“微型反应器”系统，比如Applikon Biotechnology的micro-Matrix或m2p-labs的BioLector，也可以利用一组摇瓶。

当然，这一切并非线性放大。例如，开发工作往往是分批培养，而生产是以更高密度的灌注模式开展的，利用中空纤维反应器。在这种情况下，一些培养的特征是不同的，意味着结果也可能不同。同样地，液体表面体积比往往也不能直接放大，这会影响DO和CO2，从而影响pH水平。

优化下游（收集和纯化）过程同样重要。你需要筛选填料，以便实现最佳的分离效果。其他考虑因素包括填料在分离条件下的稳定性，树脂的刚性和柱尺寸。据Kuystermans介绍，为了确保放大过程中目标蛋白在柱中的停留时间恒定，柱的直径可以增加，但柱床的高度应保持不变。

尽情摇摆

悬浮培养物的放大可以在可重复使用的生物反应器中进行，Kuystermans称之为“clean and play”的系统。这主要指的是搅拌瓶或罐，能够监测和控制各种参数。

不过，如今在工业环境中，更流行使用一次性的生物反应器，如GE Healthcare的WAVE波浪生物反应器、赛多利斯的BIOSTAT® STR搅拌罐式生物反应器以及Pall的类似产品。这些包括搅拌罐内的一次性使用袋以及一次性的旋转瓶。

Wilson Wolf公司开发出了静态的G-Rex®，它实际上是一个细胞培养瓶，其底部有硅胶模，便于被动的气体传递。据Wilson Wolf的首席运营官Mark Hirschel介绍，这让细胞能够在高密度下生长。“添加大量培养基，静置一星期，你就能得到相当量的抗体。大约每500至1000 mL能得到500至600 mg，这接近20 L的生物反应器。

蛋白生产本身就是件麻烦事，而放大更是难上加难。你需要费点心思，才能让做好这一切。但是当你确定每一件事之后，你会发现蛋白产量比你想象的还要高。这一切都是值得的。

（作者：Josh P. Roberts/生物通编译）