癌症干细胞分离培养指南手册（专家版）

生物通报道：多年来，癌症研究人员都在试图解答为何经过了成功的化疗或者放疗的患者，还是会出现复发呢，这个问题直到上个世纪70年代末的时候，癌症干细胞假说的出现才有了答复，科学家们假定了一小部分的癌细胞可以无限期地自我更新，从而引起不同细胞类型的肿瘤。这一假说也解释了为什么许多癌症药物会对标准的治疗进程产生抗药性：这些药物并没有影响到干细胞群。

如果这一假说成立，那么针对癌症干细胞的药物也许能完全治愈癌症。也就是为何时至今日，这么多科学家们都在努力研究癌症干细胞，了解它们是如何在癌症治疗后继续生存的。

最早研究人员是在1997年发现了急性髓系白血病（AML）血液样品中的癌症干细胞，但是由于采用表面标记物证明实体肿瘤中癌症干细胞的存在，常常会出现不一致的结果，因此这一理论也引发了激烈的讨论。

但是近年来科学家们在所有癌症类型（胶质母细胞瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中发现了具有自我更新能力，启动肿瘤发生的细胞，因此讨论不再围绕着“癌症干细胞是否存在？”了，而是变成了“癌症干细胞的类型有多少种？”

要想了解癌症干细胞并不容易，其中一大阻碍就是癌症干细胞的获得，许多医院会对肿瘤样品进行冷冻切片，而要从解冻组织中获得可用的细胞就没有从新鲜样品中取样那么简单了。另外一个问题在于根据细胞表面标记分离高纯度的细胞群。近期The Scientist杂志找到了一些专家，请教了他们在这些方面的经验。

如何处理患者样品

来自多伦多大学的John Dick教授是癌症干细胞研究的鼻祖，就是他在做实验的时候发现，并不是所有的癌细胞都是经历相同的步骤发展而来的。尤其是其中小部分的具有自我更新能力的白血病细胞能发展成肿瘤，由此他将能发育成肿瘤的变异细胞命名为癌症干细胞。

对于样品处理，他认为能否从临床医生那里获得新鲜组织是成功分离出癌症干细胞的关键，即使这很困难，但是用移液器或轻轻从患者样品切片，并将其放置在冰上，能最大限度的保存可用的分离细胞。

从患者样品中分离癌症干细胞的第一步就是保存肿瘤的单一细胞悬浮液。对血液肿瘤进行研究的好处在于癌细胞已经存在于单一细胞悬浮液中了，通过已有的Ficoll分离手册，就能将其与红血细胞和血小板分离开来。同时为了放置Ficoll溶液溅出来，来自斯坦福大学的Christopher Dove建议在试管下面放一个玻璃巴氏滴管，这样就能通过滴管将溶液倒出来。淋巴细胞零污染十分关键：如果你认为红细胞可能也带进去了，那么就需要重做Ficoll分离。

如果要处理冷冻过的血液样本，Dove建议将冷冻样品转移到DNase溶液中，用以降解在快速冻融过程中细胞死亡产生的DNA，这些DNA很“粘”，会将细胞黏在一起，加入DNase就能保持单细胞悬浮状态。“如果你解冻了4000万个细胞，但结果只计数到了300 万个细胞，不知道其它3700 万个细胞去哪儿了，那么就可以尝试DNase，”他建议道。

另一方面，对于实体肿瘤来说要得到单细胞溶液就需要进行机械和化学处理了，这个过程常常会造成细胞损伤，因此研究人员需要额外注意使用的酶，例如，应避免使用胰蛋白酶，这种酶通常在培养过程中用于通行细胞，会清除细胞表面标记物，造成后期无法检测干细胞。

来自多伦多大学的Catherine O’Brien则采用了一种作用温和的酶：TrypLE Express，也可以用胶原酶作为胰蛋白酶的替代物，通常1厘米大小的肿瘤正合适，可以获得可用的产物溶液。而来自哥伦比亚大学的病理和细胞生物学教授Piero Dalerba建议根据不同的肿瘤类型调整酶的种类和用量，比如大肠癌细胞生长在单层里，因此较易从患者组织中分离开来，对于这些更难的肿瘤，Clevers建议用胶原酶浸泡过夜。

通过流式细胞仪分选干细胞

下一步就是通过流式细胞仪将癌症干细胞从单细胞悬浮液中分离出来。

癌症干细胞通常是通过细胞表面的标记物进行识别，并利用荧光共轭的抗体进行染色（现下设计出了靶向不同标记物的不同颜色荧光试剂），这样流式细胞仪就能从悬浮液中检测到这些荧光细胞。虽然目前许多染色指南采用的是单克隆抗体，但是一些小心的研究人员还会加上一个封闭步骤，用以阻止抗体识别出假阳性。

斯坦福大学的干细胞生物学与再生医学研究院主任Irving L. Weissma教授是世界顶级的生物医药科学家，免疫学、癌生物学、干细胞、肿瘤免疫和细胞治疗等领域的权威，美国国家科学院和国家医科院两院院士，文理科学院院士。他曾在世界上最早发现、分离和纯化造血干细胞，并成功用于癌的细胞移植治疗，被誉为“干细胞科学的鼻祖”。

Weissma教授建议道，仅仅采用一种标记物分离AML干细胞并不够，这个由正常造血干细胞分化成AML癌细胞的过程我们了解的比较多了，因此应该进行最具特异性的标记进行分离。Weissma教授建议从AML干细胞群中要分离出CD34+，CD38-，CD90+，和Lin-细胞群。

对于实体肿瘤，专家则指出研究人员需要先对目标癌症的干细胞文献非常了解熟悉，虽然研究已经发现Lgr5 能标记结肠癌肿瘤干细胞，但细胞表面的Lgr5 表达一般较低，其它的标记，如EpCAM、CD44和CD166也已由多项实验证实，可以用于癌症干细胞分离（PNAS, 104:10158-63, 2007; J Clin Pathol, 65:140-45, 2012; Oncol Lett, 7:1544-48, 2014）。

来自斯坦福大学的Michael Clarke是首位从实体肿瘤中分离出癌症干细胞的科学家，他警告说虽然细胞表面的标记物可富集，但是这些标记物并不能确保分选出来的细胞就会发展成一个完整肿瘤——验证癌症干细胞的关键一步。由于实体肿瘤的癌症干细胞标记差异很大，因此研究人员需要通过移植实验对单个肿瘤的所有细胞类型进行检测。

“对于大多数人来说最棘手的就是分选，”Dove说，“流式细胞仪操作并不便宜，也不容易，研究人员如果没有经验就需要摸索各种阈值，校准和参数。而且更重要的是，利用抗体分离癌症干细胞会由于发射光谱重叠而造成紊乱，研究人员应该仔细分析实验中采用的每种单克隆抗体的用量，比较不同的荧光基团抗体组合效果，换句话说，这就是一个费时费力的优化过程。

小鼠体内实验

通过流式细胞仪分离细胞的“金标准”对于癌症干细胞研究来说并不完整，后者还需要将干细胞移植到免疫功能低的小鼠体内，检验这些细胞是否能发展成一个完整肿瘤。这一过程通常包括稀释细胞，按不同稀释量注射到小鼠体内，如果一个肿瘤中的细胞数量与其最初注射的细胞数量成正比，那么就能肯定实验获得的细胞就是癌症干细胞了。

对于血液癌症，比如AML来说，细胞可以通过尾静脉注射进行移植，AMLs通常在两个星期后就会生长出来。

而对于实体肿瘤来说，细胞常常是移植到肿瘤形成的器官附近，稀释后的细胞组分会与基底膜（一种用于支持细胞生长的凝胶状蛋白）混合，像是结肠癌肿瘤，在注射后平均100天内就能形成肿瘤，但是在8个星期至6个月的时间里小鼠任何地方也都有可能长出肿瘤来。

来自斯坦福大学的Michael Clarke认为乳腺癌的操作方法又不同，可根据小鼠性别和细胞输入方法而发生变化，他建议乳腺癌干细胞应该与雌激素药物一同注射到雌性小鼠的乳腺脂肪垫上（由于雌激素常参与乳腺癌的发展），而三阴性乳腺癌则需要2-6个月的时间才能生长出来，ER+肿瘤需要一年时间。

对于移植实验来说需要注意的一点就是，并不是所有分离出来的癌症干细胞都能移植生长出来，其中的原因目前还不清楚，但这可能是癌细胞生长还需要其它的免疫细胞类型，尤其是实体肿瘤。

从病患体内活动细胞，到将其注射到小鼠体内这一段时间也很重要，“越快将这些细胞移植入小鼠中，移植成功的可能性越大，”Clarke说。来自多伦多的John Dick研究组则通过加紧与临床医师们的联系，能在短短两个小时时间内就能将AML病患样品移植到小鼠体内。

体外实验

体外检测也有助于确定癌症干细胞，而且也能进行相关的癌症生物学研究。由于癌症干细胞似乎是在三维基底膜的环境下生长的更好，因此研究人员常常采用立体形成分析方法来检验这些细胞的自我更新能力。

一种体外方法就是组织化培养体系（organoid culture system，生物通译），也就是说包含生长因子的一种三维培养基，帮助细胞形成微器官。Clevers 实验室在2009年开发出了一个这样的体系，能生长出内小肠和结肠的结构，被称为肠腺(intestinal crypts)，之后研究人员还将这一技术扩展到癌细胞中（Gastroenterology, 141:1762-72, 2011）。

这些体外实验不能替代体内移植验证实验，在小鼠体内无法形成肿瘤的癌症干细胞在培养基中也能生长，反之亦然，因此两项实验都要进行。

另外需要注意的是像是AML这样的血液癌症培养条件目前还未建立，与实体肿瘤不同，这种癌症并不需要表面附着生长，为了解决这个问题，研究人员一般都是通过小鼠进行体内实验。

最后一旦能确定这些分离出来的是癌症干细胞了，就可以在小鼠或者组织化培养基中进行扩增了。这些癌症干细胞也能用于药物筛选，以及其它体内体外实验。当然需要尽可能的保证纯合的细胞群，尤其是在测序和基因表达谱分析实验中。“我们保存的癌症干细胞是否就是一个纯的细胞群，目前还没有答案，”Weissman说。

（生物通：张迪）