KASP 高通量SNP检测技术

我们知道，以个体间遗传物质内核苷酸序列变异作为基础的遗传标记，可以直接反映DNA水平的遗传多态性，这就是分子标记,至今经历了**代到第三代分子标记技术的发展。

**代分子标记的代表是RFLP，即限制性片段长度多态性，在对研究样品基因组信息不清楚的情况下，使用随机选择性酶切以后进行电泳，利用众多条带的多态性进行区分，目前已基本被淘汰；

第二代分子标记是SSR和STR，即简单序列重复数，目前还被广泛应用，但存在等位基因数目过多，人工判别不准确，实验可重复性差，分布密度不足等问题，正在被第三代标记技术替代；

随着进入后基因组时代，第三代分子标记应运而生，就是SNP，即单核苷酸多态性。它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性。与**二代不同，SNP具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，就如二进位制相对于十进位制，更适合于计算机算法一样，更容易实现高通量和自动化检测。

SNP研究已成为现在*热门的课题，其应用非常广泛，在农业领域中，可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在医学领域中，主要是疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等，生命科学研究的方方面面，都与之相关。

SNP的研究主要分为SNP的发现及SNP的基因分型。SNP的发现是应用的基础，而SNP的基因分型是应用的技术手段。新SNP通常是基于NGS技术，利用已有数据库，对多个样本进行重测序发现的，但需要进行其他方法的验证，而已知SNP的基因分型可以通过芯片技术来筛选与表型相关的SNP，从中优选出多态性高，均匀分布的少量SNP，这些少量的SNP可以在大量样本中进行检测，通常采用的技术如英国LGC（政府化学家实验室）公司的KASP技术。

英国LGC (Laboratory of the Government Chemist 政府化学家实验室)有限公司成立于1842年，是集实验室服务、测量标准、标准物质及实验室能力验证于一体的市场领导者。LGC基因组学（LGC Genomics）作为其新设的技术部门，为全球的基因组学实验室提供了*新的技术方法和设备，KASP技术已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。

KASP是竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR）的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中（甚至是一些复杂基因组的DNA样品），对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。
如下图所示，这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。实验流程主要包括：

• 准备：
1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；
2）带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；
3）DNA 模板
• PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。

 
图1 KASP检测原理

基于KASP技术，LGC公司整合了一套高通量，低成本，灵活，快速的仪器SNPline系统及实验方案，如图2所示，每天可检测SNP数量从20个到500,000个以上，样本数可从单个到数万个以上，有很强的灵活性。该实验方案包括：

• 高通量自动核酸抽提
• 自动化基因组DNA分液及PCR 体系构建
• 全自动封膜仪
• 可用于96，384，1536孔板高通量PCR的水浴PCR仪
• 微孔板荧光分析仪
• 实验设计，流程管理及数据分析软件

 
图 2 实验流程图

该实验方案具备如下特点：
• 优异的准确性
- 独立评价的准确性>99.8%
- 业内领先的SNP&InDel 分析的转化率(>90%)
• 超强的灵活性
- 设计的高度灵活性带来更高的成功率
- 支持低/中/高通量研究以及单个重复实验
- 对液体处理系统，PCR仪和荧光分析仪等设备有良好的兼容性
• 前所未有的低成本
- 无需昂贵的双色标记探针，同样成本获得两倍数据量
- *低的DNA样本需求 (根据基因组大小不同只需 0.1-10 ng)
- 无需全基因组扩增 (Whole Genome Amplification, WGA)
• 高效的成熟技术
- 工作流程已经在世界上*高通量的基因分型实验室广泛使用（杜邦先锋、先正达、KWS、Bayer、Dow Agroscience等超级种子企业）。
- 超过100多个物种的基因分型
- 目前已经开放数据的验证基因分型Panels：人，小麦，大鼠，小鼠，斑马鱼，小扁豆、西红柿等

由于SNPline仪器系统的高度灵活性，其应用也十分广泛，适合于各种基因分型研究，无论是中低通量SNP研发项目，NGS之后的SNP验证，农业种群研究，或者大量种子的生产QC和生物样品库 DNA Biobanking等都是其适用的范围。

国内一线的农业研究单位及种子企业，如中国农科院，北京市农林科学院，中国农业大学，南京农业大学，华中农业大学，中种集团，华智水稻生物技术有限公司，中玉金标记生物技术有限公司等，都已经购置上述SNPline系统或采购KASP试剂，进行SNP分析，为分子辅助育种和品种鉴定提供技术平台和数据。

其实KASP技术的应用，远不限于农业科学方向，目前运用KASP技术已发表的文献有2118篇，其中Nature及Nature子刊（genetics、communications等）50多篇，Blood 12篇，Cancer research 4篇，Cell 4篇，Science 6篇等，涉及大部分高影响因子刊物。近三年发表的文献，关于人类的文献发表有705篇，动物的有194篇，医学方向的占了很大一部分，主要涉及癌症、代谢疾病、心血管疾病、糖尿病、动植物育种、水产养殖等多种不同研究领域。

如果暂时不购置仪器的话，您还有一个选择：技术服务，基因有限公司将LGC公司的SNPline 基因分型仪器平台和KASP技术服务体系已经引进中国，您可以体验到国际领先的SNP基因分型技术。

该实验室位于上海市闵行区紫月路505号。这是一个高通量的基因分型实验室，能为用户提供高质量的分型数据，提供准确、稳定和低成本的基因分型服务解决方案，实验室每天可以产生的数据点达十万个。我们的服务优势是高通量、高质量、低成本。

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