遗传病家系的高通量测序：您需要了解的一些事

摘要

高通量测序技术的出现与普及，为遗传病的研究带来了前所未有的机会。它提高了遗传病致病基因克隆和鉴定的效率，使人类对自身基因功能的认识大大加速。本文对遗传病家系的高通量测序分析提出一些注意事项，希望有助于相关的研究。

前言

我国是一个多民族的人口大国，也是遗传病家系资源比较丰富的国家之一。遗传病家系是生命科学基础理论探索和实际应用研究的宝贵材料，是解读人类基因功能的重要证据。依赖于对遗传病家系的连锁分析，对致病基因进行定位克隆曾经是研究遗传病致病基因的重要手段。通过连锁分析对致病基因进行精细定位，往往不容易实现，这需要较大或较多的家系。因此，遗传病致病基因的定位克隆并不容易。近十年来，高通量测序技术的出现与普及，为遗传病的研究带来了前所未有的机会。它提高了遗传病致病基因克隆和鉴定的效率，使人类对自身基因功能的认识大大加速。技术上的进步，使得近几年全世界范围内遗传病研究成果迅速涌现，国际上相关科研论文的发表量也连年快速上升。在国内，许多科研团队准备或者已经用高通量测序技术对所收集的遗传病家系进行分析。上海伯豪生物在多年从事高通量测序技术服务的基础上，对遗传病家系的高通量测序分析提出一些注意事项，希望有助于相关的研究。

一．遗传病家系信息的收集及样本的采集

对所感兴趣的遗传病事先进行充分的了解是非常重要的。它是真正的遗传病吗？遗传病由遗传物质改变引起，可在家族内聚集，但有些在家族内群发的疾病并非遗传病。它的发病频率有多少？发病频率的大小涉及到高通量测序数据的过滤分析，需要注意。它是单基因遗传病还是复杂性状遗传病？后者的研究难度较大。如果研究者不是相关专业的医生，与医疗机构的临床专科医生或遗传咨询医生合作将非常有助于即将进行的研究。合作可以使研究者在短时间内快速了解该遗传病，也可以使其有机会接触更多的该种遗传病的家系。

遗传病家系信息的收集及样本的采集直接影响研究项目的进度。对家系信息的收集，应尽可能全面、确凿，尽量避免信息的漏检和误录。尽可能邀请疾病家系中熟悉家族历史沿革和各个成员状况的代表参加患病家系的信息咨询，如果条件允许，可邀请数位代表同时参加，以确保信息来源准确。要注意家系中过继、后续亲属的情况或近亲结婚的情况。有些家系成员，尽管已经去世，但通过他人尽可能地了解该成员是否有患病症状，仍然很重要，因为这些信息可能帮助判定疾病遗传方式。全面准确的家系信息有助于判定致病基因的传递类型，有助于高通量测序个体的挑选和数据分析，而测序对象的选择和数据分析直接影响项目进度。有些家系比较小，不利于疾病位点的连锁分析定位，但仍然有应用价值。高通量测序不一定需要很大的家系；而且，可以利用多个同类疾病的小家系，进行综合研究。

对家系成员疾病症状的仔细检查、全面描述与详细记录也很重要。有些遗传病与其它遗传病有类似的或者重叠的症状，详细而充分的描述可以避免对遗传病病种的误判，避免研究出现方向性错误。一些遗传病，具有遗传和表型的异质性，不同基因的突变，虽然导致同一种疾病，但疾病症状有差异。这些症状的差异提示着致病位点的不同。精细、丰富的症状信息能为基因功能研究提供更多的线索。遗传病症状信息如此重要，以至于有人曾提出“人类表型组计划（The Human Phenome Project）”。

对遗传病家系样品的采集，应按知情同意和无害有利的原则，尽量一次采到足够量的材料，避免重复采样给家系成员带来情感和机体上的伤害，也避免因实验材料不够延误项目进程。有时，因家系成员迁移或去世等原因，重复采样并不能实现，那么，一些必要的实验只得放弃，这必然影响项目进展。采样时，既要采集家系中患者的样本，也要采集与患者有关的正常人的样本。

有些遗传病研究，可能需要从采集的样品中抽取RNA进行高通量测序。.那么，此时对样品的采集和处理方式则可能与DNA测序所需的样品有所不同。这也是需要注意的。

二. 从遗传病家系中选择合适的测序对象

遗传病家系中患者和正常人的样品采集好后，是否应对家系中每一位患者都进行全外显子组测序或全基因组测序，发现其致病变异，从而发现其致病基因呢？不一定。而且，这样做花费也比较大。有时，仅对少数患者的测序即可大幅缩小致病位点的搜寻范围。如果致病基因的较详细的定位信息已经通过其它方法得到，有时只需测定一位病人就可发现致病位点。对于呈孟德尔方式遗传的遗传病，疾病在家系中的传递方式，影响着测序个体的选择和测序数据的分析策略。

常染色体隐性遗传病基因的克隆最先受益于高通量测序技术。对于一个常染色体隐性遗传病家系，如果不存在近亲结婚或生殖隔离等因素，往往患者同一致病基因的不同位点存在致病突变，即患者带有复合杂合突变（compound heterozygous mutations）。由于这类患者一般不多，可以对同胞患者及其正常双亲进行测序，分析时寻找子代复合杂合变异与双亲杂合变异共有的部分，从而发现致病位点。有时，仅对一对同胞对（sibpair）或一位患者进行测序即可发现常染色体隐性遗传病致病基因。对于近亲结婚或生殖隔离等因素导致的常染色体隐性遗传病，患者致病基因往往存在纯合突变，而患者的双亲往往是突变基因的杂合子。这时应当在搜寻在患者中呈纯合状态而在双亲中呈杂合状态的变异。在这种情况下，患者双亲的亲缘关系越远，越有利于寻找致病位点。有时只测一位患者也可发现致病基因。

疾病呈X连锁遗传方式传递的家系也适于高通量测序分析。这类家系有利于缩小致病基因搜寻范围，因为许多常染色体上的变异被排除了。譬如，对于X连锁隐性遗传病，可以对男性患者和及其母亲（致病突变携带者）进行测序，寻找X染色体上共有的的变异。然而，需要注意的是，有时X连锁与常染色体隐性遗传方式不易区分（当后者的家系中只有男性患者时），在进行相关的数据分析时需要注意。此时，前已述及的对家系中更多成员的调查就显得重要了。

高通量测序技术用于显性遗传病致病基因搜寻的难度比较大，尤其对于常染色体显性遗传病。常染色体显性遗传病，致病基因的变异在杂合状态下即可发病。常染色体杂合的变异往往很多，不容易缩小搜寻范围。如果有相关基因的较精细的位置信息（例如小于2Mb的范围）可以参考，则测定少数（甚至一个）患者即可确定致病位点。否则，则需要测定较多的患者。当确实需要对家系内多个患者进行测序时，尽可能选择亲缘关系较远的（如图1所示）。也可以对家系中的患者和正常人进行测序，在数据分析时，在前者发现的杂合变异中，除去那些在后者中存在的杂合变异，余下的部分则包含致病变异。

图1. 显示本家系中对亲缘关系较远的患者(III-2和III-4)的测序比对亲缘关系较近的患者（II-2和II-3）测序更容易发现致病突变位点（摘自Hinchcliffe MJ. Managing incidental findings in exome sequencing for research. Methods Mol Biol. 2014;1168:207-25.）

对于某些新生突变（de novo mutations）所致遗传病致病基因的搜寻则比较容易。对该类突变的患者及其双亲（parent-child trios）进行测序，即可检出在患者中出现而在双亲中没有的、为数不多的变异。多测几个家系即可锁定致病基因（有时两个家系即可）。如果没有双亲样品，也可通过对多个患者的测序找出致病基因。有时只测一个患者也有可能发现新生突变。

总之，充分利用家系信息和疾病基因的已有定位信息进行高通量测序，既可减少测序花费，也有利于后续数据分析。

三．高通量测序结果的确认与验证

一次人类全基因组测序给出的未经过滤的变异位点可达三四百万个；一次人类全外显子组测序给出的原始变异位点可达2-5万个。从这些位点中寻找出真正导致所研究的疾病的变异犹如大海捞针。对于全外显子测序来说，通过测序质量（如至少覆盖的reads数等）、变异位置、变异类型、最小等位基因频率（minor allele frequency, MAF）等指标的过滤，可选择的变异数可降至数千。将这些变异再与公开发布的已知变异数据库或实验室内部建立的变异数据库比较，则可将候选变异数再降低至数百。如果对一个家系中多个患者或携带者进行测序，还可通过综合分析，进一步降低候选变异数，从而使真正的变异“水落石出”。实际上，这一过程存在例外情况和变量。有些控制指标如测序质量的控制、最小等位基因频率的设定是人为可调的。这些例外情况和变量影响着最终给出的数据大小和质量，造成测序结果的假阳性或假阴性的出现。

高通量测序结果的某种意义上的可变性、非唯一性，决定了测序结果验证的必要性。对于序列本身的变化当然可以用一代测序的方法进行验证。这并不困难。但对遗传病家系测序（无论是一代测序还是高通量测序），所检出的变异，在功能认可上出现假阳性和假阴性的结果时有发生。Bell C.J等 2011年报道，在406个已发表的声称引起严重遗传病的突变中，有122个（占27%）要么只是一些普通的多态，要么缺乏致病性的证据。另外一些报道则发现正常对照人群中存在不少致病变异。一些报道的所谓的致病变异被后续的研究所质疑，更多的假阳性可能还未被发现。错误的、不全面的结论对于遗传病的基础研究和临床诊疗危害非浅。这提示对测得的变异或变异所在的基因进行功能研究很重要。当然，这种对家系中有些变异的功能的错误解读，并非只有高通量测序才有。需要对变异所在的基因和变异本身，从遗传学、生物信息学等角度加以考察，并结合相关实验，才能得出与功能（致病性）相关的结论。任何致病性方面的结论得出时都是需要谨慎考虑的。

结语

高通量测序技术用于遗传病致病基因的克隆鉴定，是近几年的事情。它省去了对基因的作图定位等烦琐步骤，省时省力。在中国这样的遗传资源大国，该技术应用前景广阔。本文提到了遗传病研究采用高通量测序技术时需要注意的一些问题，希望对读者有所帮助。