单细胞研究,你准备好了吗?[创新技巧]

【字体: 时间:2015年09月28日 来源:生物通

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  以往,细胞生物学家都在研究大量的细胞。如今,一部分研究人员开始逆转这一潮流,勇敢迎接单细胞分析的挑战。这时,挑战就来了,你没有那么多细胞。如今,越来越多的工具也许能帮助研究人员应对挑战。

以往,细胞生物学家都在研究大量的细胞。如今,一部分研究人员开始逆转这一潮流,勇敢迎接单细胞分析的挑战。

《Nature Methods》将2013年度技术授予了单细胞测序。正如社论中所说,“每个细胞都是独一无二的 – 它占据了独特的空间位置,它的复制基因组中携带了独特的错误,并经过编程,引起基因表达的变化。然而,大多数的DNA和RNA 都是在组织样本或细胞群体上开展的,其中细胞之间的生物学差异被平均值掩盖。单细胞方法提供了一种方式来剖析这种异质性。”

不过,GE Healthcare生命科学部的全球产品经理Cynthia Potter认为,单细胞分析面临许多技术上的挑战。不当的样品处理,不完全的细胞裂解,核酸的二级结构和高GC含量,及残留的组蛋白 – 这些因素都对单细胞分析的结果产生不利影响。

这是因为单细胞生物学仅仅涉及单个细胞。“肿瘤或组织中每个细胞的RNA、DNA和蛋白都相差甚远,”Potter说。“若要捕获异质性,你必须了解全部的东西,也就是整个基因组、转录组、蛋白质组或代谢组。”这时,挑战就来了,你没有那么多细胞。如今,越来越多的工具也许能帮助研究人员应对挑战。

获得单细胞

就单细胞分离而言,研究人员有好几种选择:物理上的显微操作、激光捕获显微切割、流式细胞术和微流体。

举个例子,研究人员可以将单个细胞直接分选到单管或单孔中。可用的工具包括Bio-Rad自动化的S3e细胞分选仪,它经过预先设置,将细胞分选到8联管中,或贝克曼库尔特的MoFlo Astrios EQ,它能够将单个细胞分选到1536孔板中。

当然,整个过程需要非常小心,以确保每个细胞都完成了分选。Bio-Rad的产品经理Melissa Ma估计,S3e上每个液滴的体积只有3 nl。“有时候,如果分选仪的设置不正确,细胞可能会丢失。S3e提供了ProDrop技术,可确保精确分选,并尽可能提高分选细胞的回收率,”她说。

Fluidigm的C1则是细胞分选的补充。据该公司的营销总监Candia Brown介绍,研究人员可以利用C1这个自动化的微流体平台,将单个细胞放在IFC设备的单细胞反应室中,进行细胞染色、观察、裂解和扩增 – 全部都自行完成。它也可以用在FACS的下游,让分选仪分离出特定的细胞,而C1来完成分析。

Brown解释说,C1有助于提高单细胞分析的通量。之前,细胞分离和处理的步骤都很费力,研究人员需要拼凑多种不同的技术来推动他们的流程。因此,通量很低,重复性也不高。“C1改变了这个游戏,”她说。“通过整合和标准化,它让这个过程变得可重复,并且可扩展。”的确,原先每块IFC只能处理96个细胞,但现在已经增加到800个。每次能处理两块板,这样就能处理1600个细胞。

据介绍,Fluidigm很快还将推出一款新的仪器平台Polaris,适用于单细胞的功能基因组学。Polaris系统在1月发布,计划在未来几周内推出。它将让研究人员在多达48个不同的环境条件下测试单个细胞,比如,测试六种药物对八个生物学重复的基因表达影响。

我想详细了解Fluidigm的单细胞分析工具

接着干什么?

在获得单细胞之后,你可能想要了解里面的内容。核酸扩增往往是个必不可少的步骤。据Potter介绍,单个人类细胞只有6 pg DNA,对于新一代测序、变异分析以及其他下游工作而言还是太少。因此,大多数研究人员利用某种形式的全基因组扩增(WGA)来扩增材料。“这对单细胞而言特别重要,”她说,“因为你无法得到另一个细胞 – 每个细胞都是不同的。”

由于这是单细胞的研究,在选择WGA策略时,错误率和序列覆盖度就显得尤为重要。GE Healthcare的illustra Single Cell GenomiPhi DNA Amplification Kit在等温多链置换反应中使用高保真的Phi29 DNA聚合酶,从单个细胞中产生4-7 mg DNA。

对许多研究人员来说,无论是探索基因组还是转录组,NGS都是单细胞流程的最终目标。Fluidigm的C1系统如今支持七种NGS下游应用,包括靶向基因表达分析、miRNA图谱分析、单细胞mRNA测序、靶向DNA测序、全外显子组测序、全基因组测序以及表观遗传学流程(ATAC-seq)。

探究异质性

不过,Bio-Rad数字生物学中心的产品经理Elaine Wong-Ho认为,对于那些只要定量几个转录本的研究人员来说,当然还有更简单的选择。例如,数字PCR的通量虽然不及NGS,但更便宜、更快速,也更容易分析。“大多数研究人员不需要计算上的帮助,也能开展这类分析。”

据她介绍,S3e细胞分选仪上分离出的细胞可直接放入SingleShot Cell Lysis Kit的裂解液中,并融入他们微滴式数字PCR(ddPCR)的流程。由于每个裂解液提供了足够两个反应的材料,而每个反应可检测五个转录本,故研究人员可准确定量每个细胞中的10个mRNA。

流式细胞仪本质上也是一种单细胞分析平台,不过它主要侧重于表面蛋白的表达。若想全面了解单细胞蛋白质组,可以尝试一下Fluidigm的Helios质谱流式平台。此外,研究人员还可以使用默克密理博的Amnis成像流式细胞仪来关联细胞形态、蛋白质定位和RNA表达。

随着越来越多的工具推向市场,且处理单细胞的方法越来越简单,预计单细胞研究的兴趣会大增。毕竟,细胞群体的异质性不会消失。

(作者:Jeffrey M. Perkel / 生物通编译)

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