中科院王皓毅博士:开发新型通用CRISPR-Cas9-Pumilio系统

【字体: 时间:2016年01月19日 来源:生物通

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  来自美国Jackson实验室、中国科学院动物研究所和辛辛那提大学的研究人员报告称,他们通过组合CRISPR-Cas9和Pumilio RNA结合蛋白,构建出了一种可用于基因调控及基因组标记的万能系统,他们将之命名为Casilio系统。这一重要的研究成果发布在1月15日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上。

  

生物通报道  来自美国Jackson实验室、中国科学院动物研究所和辛辛那提大学的研究人员报告称,他们通过组合CRISPR-Cas9和Pumilio RNA结合蛋白,构建出了一种可用于基因调控及基因组标记的万能系统,他们将之命名为Casilio系统。这一重要的研究成果发布在1月15日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上。

中国科学院动物研究所基因工程技术研究组组长王皓毅(Haoyi Wang)研究员,及任职于Jackson实验室和辛辛那提大学的Albert W Cheng是这篇论文的共同通讯作者。

由于其简易及有效,近年来CRISPR-Cas9系统被广泛用于基因组编辑。核酸酶缺陷突变体dCas9蛋白可以与一些效应结构域进行融合,这样的融合蛋白可由sgRNAs引导至基因组位点来调控基因表达或标记染色体。

例如,在2013年,华人科学家齐磊(Lei S. Qi,音译)就开发出了一种称作为CRISPR干扰(CRISPRi)的系统。在这一系统中,是将缺失核酸内切酶活性的Cas9与一种导向RNA共表达,由此产生一种DNA识别复合物,这种复合物能特异性干扰转录延伸,RNA聚合酶结合,或转录因子结合。这种RNA导向的DNA识别平台是基因组范围内基因表达选择性抑制的一种简单的新方法(延伸阅读:华裔博士连发Cell,Nature:基因沉默新技术)。

然而,由于独特的sgRNA:Cas9配对,在大多数这样的实验中只能应用一种类型的效应蛋白。直接融合多个拷贝的效应蛋白与dCas9来获得充分的效应蛋白活性存在着技术挑战。结合利用MS2和PP7一类病毒RNA序列的RNA适配子方法与CRISPR-Cas9系统为提高多路复用性及多聚化提供了工具,但当前只有有限数量充分确定特征的RNA适配子。并且,将三个或以上拷贝的这些结构化适配子整合到sgRNA上会降低sgRNA表达,由此限制了可招募效应蛋白的数量。

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在这篇文章中研究人员报告通过组合CRISPR-Cas9和Pumilio RNA结合蛋白建立了Casilio系统。Pumilio和FBF蛋白都具有一个保守的Pumilio/FBF (PUF)RNA结合结构域——这一结构域可编程来结合一种特异的8-mer RNA序列(PUF结合位点,PBS)。这一Casilio系统是由dCas9蛋白,附带有一个或以上PUF结合位点的一条sgRNA(sgRNA-PBS),和与PUF结构域融合的一个效应蛋白(PUF融合蛋白)所构成。


研究人员证实这一Casilio系统可实现转录调控因子,表观遗传修饰蛋白及荧光蛋白在定义基因组位点上的多路复用及多聚化。Casilio系统的主要优点包括有:(I)多路复用性。可同时将不同的Casilio模块传送到细胞中,每个模块可在定义靶位点上运作,独立发挥作用。由于可以很容易地编程PUF结构域来识别所有8-mer RNA模体,这样大大扩展了独立Casilio模体的潜在数量。

(II)多聚化。线性8-mer PBS模体简易性可实现sgRNA-PBS上广泛的PUF融合蛋白多聚化,且不会阻碍sgRNA转录或dCas9/sgRNA DNA结合活性。这一特征使得能够将多个PUF融合蛋白分子组装到sgRNA上,在局部集中效应蛋白或蛋白质标记。这对于荧光成像或转录调控尤其有用。

(III)复合物形成。通过进一步的开发和优化,sgRNA-PBS有潜力成为PUF引导组装化学计量确定的蛋白质复合物的一个RNA支架。

考虑到这些优点,作者们表示相信这一Casilio系统将为研究基因功能和染色质结构的一种强大工具。

王皓毅在麻省理工学院Rudolf Jaenisch实验室进行博士后研究时就曾参与了CRISPR技术的早期开发,近年来发表了一系列介绍CRISPR技术的重要文章。

此前,在《Mamm Genome》杂志上发表的一篇文章中,王皓毅研究员和合著者们不仅简要地为我们概述了这一快速发展的领域,介绍了CRISPR–Cas9系统以及它在基因组编辑中的应用,还着重介绍了设计CRISPR/Cas9向导RNA(guide RNA, gRNAs)的基本要点,减少脱靶效应的策略,利用CRISPR/Cas9构建小鼠模型的基本策略和注意事项,以及CRISPR/Cas9当前面临的一些挑战以及未来的发展(延伸阅读:王皓毅博士教你玩转CRISPR–Cas9)。

在发表于《Genetics》杂志上的另一篇研究论文中,王皓毅研究员证实利用电流来传送CRISPR/Cas9系统,不仅使得CRISPR/Cas9能够高效地实现实验室小鼠遗传改造,并且可显著提高这一系统的通量(延伸阅读:王皓毅博士:提高CRISPR/Cas9效率和通量的新策略 )。

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文摘要:

Casilio: a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid for gene regulation and genomic labeling

The CRISPR-Cas9 system has recently been widely adopted in genome editing due to its simplicity1,2,3. Nuclease-deficient mutant dCas9 protein can be fused to effector domains and the fusion proteins can be guided by sgRNAs to genomic sites to regulate gene expression or label chromosomes4,5,6,7,8,9,10. However, only one type of effector is applied in most experiments due to the exclusive sgRNA:Cas9 pairing……

王皓毅

男,1979年10月出生于河北省,博士,研究员,中国科学院动物研究所基因工程技术研究组组长。

2001年于厦门大学获得生物学学士学位,2003年于美国迈阿密大学获得动物学硕士学位。2009年于美国华盛顿大学获得分子细胞生物学博士学位,研究方向为转座子基因工程技术。2009年至2014年在麻省理工学院Rudolf Jaenisch实验室进行博士后研究,研究方向为特异性定点核酸酶在全能性干细胞和小鼠中的基因工程技术开发。主要研究方向为基因工程技术和表观遗传修饰技术的开发和应用,在近年研究中取得多项成果,包括率先成功地利用TALEN系统对于人类胚胎干细胞和诱导性干细胞进行了精确高效的基因敲除和敲入操作;利用TALEN系统建立了世界上第一只Y染色体上的基因敲除和敲入小鼠;率先利用CRISPR/Cas系统建立了在胚胎干细胞中进行多基因敲除的方法,并通过受精卵注射一步获得多基因敲除的小鼠;通过受精卵注射CRISPR/Cas系统的同时提供DNA单链和双链供体,获得基因原位敲入小鼠和条件性敲除小鼠。相关研究成果发表在Cell、Nature Biotechnology、Genome Research、Cell Research等杂志上,并获得科学同行的极大关注和科学媒体的广泛报道,曾被著名科学网站GenomeWeb评选为全世界二十名最值得关注的青年科学家之一。已发表SCI收录论文16篇,影响因子10分以上11篇,总引用次数超过800次。

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