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转染是个坎,让我教你怎么翻过去[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年1月28日 来源:生物通

摘要:

  各种细胞适用的转染条件都可能不同,正所谓甲之蜜糖、乙之砒霜,并没有一种放之四海而皆准的方法。因此,研究人员需要根据你的细胞类型和实验要求来选择理想的方法。何谓理想的方法?那就是转染效率高、细胞毒性低、对正常生理的影响最小,并且简单可重复。这看似挺难,好在Thermo Fisher(原Life Technologies)带来了一个转染的整体解决方案,可帮助你快速实现目标。

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从基因表达到RNA干扰,再到如今大热的基因组编辑,它们都离不开一个前提:DNA或RNA分子能够高效地导入细胞内并发挥功能。然而,问题是,细胞并不想接收它们,而细胞膜也是一个可怕的屏障,它带的是负电荷,核酸同样带负电荷。

不过,人类的智慧是无限的。人们已经设计出各种方法来绕过这一屏障,包括化学方法,利用带正电的转染试剂来中和带负电的核酸;生物学方法,采用经过遗传学改造的病毒将非病毒基因转移至细胞内;以及物理方法,在细胞膜上开孔,将核酸直接送入细胞。

当然,各种细胞适用的转染条件都可能不同,正所谓甲之蜜糖、乙之砒霜,并没有一种放之四海而皆准的方法。因此,研究人员需要根据你的细胞类型和实验要求来选择理想的方法。何谓理想的方法?那就是转染效率高、细胞毒性低、对正常生理的影响最小,并且简单可重复。这看似挺难,好在Thermo Fisher(原Life Technologies)带来了一个转染的整体解决方案,可帮助你快速实现目标。

既高效又温和的DNA转染——Lipofectamine™ 3000

对于DNA的转染,大家往往在第一时间想到Lipofectamine™ 2000。这种金招牌的阳离子脂质体试剂几乎是人们的首选,目前引用文献已经超过50,000篇。通过带负电荷的核酸与带正电荷的合成脂质体试剂之间的静电作用,核酸-阳离子脂质体试剂复合物自发形成。细胞通过内吞作用摄取复合物,然后释放至胞浆。一旦进入细胞,转染DNA转移至细胞核内,通过未知的机制表达。

之所以如此受欢迎,首先是因为它能够高效转染各种细胞系,帮助在各种实验的第一步获得漂亮的结果,其次也因为它对DNA和RNA皆有效,适合DNA和RNA的共转染。不过,转染效率和细胞毒性,正如硬币的正反两面。Lipofectamine 2000在获得赞扬声的同时,也收到毒性高的诟病。对于顽强的细胞系而言,这可能不是问题,但是娇弱的原代细胞和干细胞却折腾不起。

为此,Thermo Fisher的科学家优化了转染过程的四个步骤,并结合最先进的脂质体纳米微粒技术,开发出最新的Lipofectamine 3000试剂。它提供了出众的转染性能和可重复的结果,适用于各种难转染的细胞和常见的细胞。由于转染性能出众,你在转染过程中可减少试剂的用量,从而进一步降低潜在的毒性风险。

3000与2000相比,转染效率如何?研究人员当然也进行了比较。他们使用这两种试剂转染来自各种组织的癌细胞。研究证实,Lipofectamine 3000试剂的转染性能明显高于2000。使用Lipofectamine 2000时,只有25%的癌症细胞系被认为是容易转染的(转染效率高于50%),而使用Lipofectamine 3000,这个比例高达60%。里斯本大学的Rui Eduardo Castro博士在使用过Lipofectamine 3000后兴奋地说道:“我们非常高兴且惊讶地看到, 在难以转染的细胞系中使用Lipofectamine 3000,可将转染效率提高10倍,而且减少了细胞死亡率。结果真是太棒了!”

因此,即使是难转染的细胞,使用Lipofectamine 3000也很容易获得满意的结果。还是有点不满意?没关系,Thermo Fisher建议你尝试一下不同的DNA浓度和细胞密度。采用阳离子脂质体介导的转染,转染时贴壁细胞达到70-90%汇合,悬浮细胞达5 x 105至2 x 106个细胞/mL,可以获得最佳的结果。还是不行?那就试试mRNA转染吧。

mRNA也能高效转染?当然!——Lipofectamine™ MessengerMAX™

关于mRNA转染,人们往往有多种误解。有人认为,mRNA难以制备。其实,这方面的工具有很多,比如Thermo Fisher的mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra转录试剂盒,就能制备20-40 ¬μg即用型mRNA。还有人认为,mRNA不稳定,容易降解。No,no!只要采取一些简单的预防措施,就能确保mRNA稳定:使用不含RNA酶的试剂和吸头,分装mRNA并置于-80ºC保存。

与DNA转染相比,mRNA转染只需进入细胞质,而非细胞核,从而大大提高了有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。这样,利用Lipofectamine MessengerMAX转染mRNA可以实现更快速的蛋白质表达,在转染细胞中达到更高的表达一致性,特别适合原代神经元、神经干细胞和永生化神经细胞。

在基因组编辑的应用中,Lipofectamine MessengerMAX试剂通过高效转染提高了GeneArt™ CRISPR核酸酶mRNA的剪切和重组效率,可以大大提高基因修饰的效率并简化下游过程。此外,mRNA不会入核,这下老板再也不用担心基因组整合的风险了。

也许你会担心,操作起来一定很复杂吧。其实,只要制备好了mRNA,转染的基本步骤与DNA相同,不外乎是稀释、孵育这些,难不倒诸位高手。况且还可以购买阳性对照GFP mRNA同时转一下,效果好不好,一看就知道。

CRISPR好帮手——Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9转染试剂

对于基因组编辑,有些人使用CRISPR质粒,有些人使用Cas9 mRNA。其实,使用Cas9蛋白可在原代细胞和干细胞中获得出色的切割效率。它避免了转录或翻译,可立即发挥作用,快速去除,最大程度地降低了脱靶剪切的几率。GeneArt™ Platinum™ Cas9核酸酶就是这样一种野生型的Cas9蛋白。

也许你要问,如何将Cas9蛋白导入细胞呢?那就要依靠Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9转染试剂了。这是第一款为CRISPR-Cas9蛋白转染而优化的脂质体纳米微粒转染试剂。这款试剂简单易用,高效低毒,如今已在iPSC、mESC、CHO等20多种细胞上进行了检验。与电穿孔相比,它更为温和,因此所需的细胞较少,每个反应的成本较低。此外,它也能轻松扩展到高通量实验,是CRISPR实验的好帮手。

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