转染是个坎,让我教你怎么翻过去[选购宝典]

【字体: 时间:2016年01月28日 来源:生物通

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  各种细胞适用的转染条件都可能不同,正所谓甲之蜜糖、乙之砒霜,并没有一种放之四海而皆准的方法。因此,研究人员需要根据你的细胞类型和实验要求来选择理想的方法。何谓理想的方法?那就是转染效率高、细胞毒性低、对正常生理的影响最小,并且简单可重复。这看似挺难,好在Thermo Fisher(原Life Technologies)带来了一个转染的整体解决方案,可帮助你快速实现目标。

从基因表达到RNA干扰,再到如今大热的基因组编辑,它们都离不开一个前提:DNA或RNA分子能够高效地导入细胞内并发挥功能。然而,问题是,细胞并不想接收它们,而细胞膜也是一个可怕的屏障,它带的是负电荷,核酸同样带负电荷。

不过,人类的智慧是无限的。人们已经设计出各种方法来绕过这一屏障,包括化学方法,利用带正电的转染试剂来中和带负电的核酸;生物学方法,采用经过遗传学改造的病毒将非病毒基因转移至细胞内;以及物理方法,在细胞膜上开孔,将核酸直接送入细胞。

当然,各种细胞适用的转染条件都可能不同,正所谓甲之蜜糖、乙之砒霜,并没有一种放之四海而皆准的方法。因此,研究人员需要根据你的细胞类型和实验要求来选择理想的方法。何谓理想的方法?那就是转染效率高、细胞毒性低、对正常生理的影响最小,并且简单可重复。这看似挺难,好在Thermo Fisher(原Life Technologies)带来了一个转染的整体解决方案,可帮助你快速实现目标。

既高效又温和的DNA转染——Lipofectamine™ 3000

对于DNA的转染,大家往往在第一时间想到Lipofectamine™ 2000。这种金招牌的阳离子脂质体试剂几乎是人们的首选,目前引用文献已经超过50,000篇。通过带负电荷的核酸与带正电荷的合成脂质体试剂之间的静电作用,核酸-阳离子脂质体试剂复合物自发形成。细胞通过内吞作用摄取复合物,然后释放至胞浆。一旦进入细胞,转染DNA转移至细胞核内,通过未知的机制表达。

之所以如此受欢迎,首先是因为它能够高效转染各种细胞系,帮助在各种实验的第一步获得漂亮的结果,其次也因为它对DNA和RNA皆有效,适合DNA和RNA的共转染。不过,转染效率和细胞毒性,正如硬币的正反两面。Lipofectamine 2000在获得赞扬声的同时,也收到毒性高的诟病。对于顽强的细胞系而言,这可能不是问题,但是娇弱的原代细胞和干细胞却折腾不起。

为此,Thermo Fisher的科学家优化了转染过程的四个步骤,并结合最先进的脂质体纳米微粒技术,开发出最新的Lipofectamine 3000试剂。它提供了出众的转染性能和可重复的结果,适用于各种难转染的细胞和常见的细胞。由于转染性能出众,你在转染过程中可减少试剂的用量,从而进一步降低潜在的毒性风险。

3000与2000相比,转染效率如何?研究人员当然也进行了比较。他们使用这两种试剂转染来自各种组织的癌细胞。研究证实,Lipofectamine 3000试剂的转染性能明显高于2000。使用Lipofectamine 2000时,只有25%的癌症细胞系被认为是容易转染的(转染效率高于50%),而使用Lipofectamine 3000,这个比例高达60%。里斯本大学的Rui Eduardo Castro博士在使用过Lipofectamine 3000后兴奋地说道:“我们非常高兴且惊讶地看到, 在难以转染的细胞系中使用Lipofectamine 3000,可将转染效率提高10倍,而且减少了细胞死亡率。结果真是太棒了!”

因此,即使是难转染的细胞,使用Lipofectamine 3000也很容易获得满意的结果。还是有点不满意?没关系,Thermo Fisher建议你尝试一下不同的DNA浓度和细胞密度。采用阳离子脂质体介导的转染,转染时贴壁细胞达到70-90%汇合,悬浮细胞达5 x 105至2 x 106个细胞/mL,可以获得最佳的结果。还是不行?那就试试mRNA转染吧。

mRNA也能高效转染?当然!——Lipofectamine™ MessengerMAX™

关于mRNA转染,人们往往有多种误解。有人认为,mRNA难以制备。其实,这方面的工具有很多,比如Thermo Fisher的mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra转录试剂盒,就能制备20-40 ¬μg即用型mRNA。还有人认为,mRNA不稳定,容易降解。No,no!只要采取一些简单的预防措施,就能确保mRNA稳定:使用不含RNA酶的试剂和吸头,分装mRNA并置于-80ºC保存。

与DNA转染相比,mRNA转染只需进入细胞质,而非细胞核,从而大大提高了有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。这样,利用Lipofectamine MessengerMAX转染mRNA可以实现更快速的蛋白质表达,在转染细胞中达到更高的表达一致性,特别适合原代神经元、神经干细胞和永生化神经细胞。

在基因组编辑的应用中,Lipofectamine MessengerMAX试剂通过高效转染提高了GeneArt™ CRISPR核酸酶mRNA的剪切和重组效率,可以大大提高基因修饰的效率并简化下游过程。此外,mRNA不会入核,这下老板再也不用担心基因组整合的风险了。

也许你会担心,操作起来一定很复杂吧。其实,只要制备好了mRNA,转染的基本步骤与DNA相同,不外乎是稀释、孵育这些,难不倒诸位高手。况且还可以购买阳性对照GFP mRNA同时转一下,效果好不好,一看就知道。

CRISPR好帮手——Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9转染试剂

对于基因组编辑,有些人使用CRISPR质粒,有些人使用Cas9 mRNA。其实,使用Cas9蛋白可在原代细胞和干细胞中获得出色的切割效率。它避免了转录或翻译,可立即发挥作用,快速去除,最大程度地降低了脱靶剪切的几率。GeneArt™ Platinum™ Cas9核酸酶就是这样一种野生型的Cas9蛋白。

也许你要问,如何将Cas9蛋白导入细胞呢?那就要依靠Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9转染试剂了。这是第一款为CRISPR-Cas9蛋白转染而优化的脂质体纳米微粒转染试剂。这款试剂简单易用,高效低毒,如今已在iPSC、mESC、CHO等20多种细胞上进行了检验。与电穿孔相比,它更为温和,因此所需的细胞较少,每个反应的成本较低。此外,它也能轻松扩展到高通量实验,是CRISPR实验的好帮手。

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RNAi的不二之选——Lipofectamine™ RNAiMAX

RNAi作为基因功能研究的基本工具,如今已应用在蛋白质抑制研究、表型分析、通路分析和药物靶点发现上。小分子RNA(siRNA、miRNA)有其自身的特点,也就需要不一般的转染试剂。

Lipofectamine™ RNAiMAX 转染试剂就是专门为小分子RNA而优化的,可以高效地将小分子RNA导入广泛的细胞系,包括常见的细胞类型、干细胞、原代细胞以及难转染的细胞。

这种转染试剂可以在10倍试剂浓度范围内获得最大的干扰效果以及极佳的细胞存活率,这个特点使得Lipofectamine™ RNAiMAX的转染条件极易优化,以便在实验中使用最低的siRNA浓度,从而降低细胞毒性。尽管Lipofectamine™ RNAiMAX的说明书建议以10 nM siRNA 作为优化干扰效果的起始浓度,但是仅用1 nM siRNA 也可以获得较好的干扰效果。

Lipofectamine™ RNAiMAX的操作也相当简单,转染后无需去除转染复合物,无需更改或添加培养基。如果转染的效果不理想,可以试试反向转染,或改变siRNA用量,或转染时的细胞密度。另外,这款试剂只能用于小分子RNA的转染,不能用于共转染。如果需要共转染,只能借助Lipofectamine 3000或2000。

体内转染不再是难题——Invivofectamine 3.0

众所周知,原代细胞的转染比传代细胞要难得多,而体内转染又比体外转染要难。对于这种高难度的实验,勉强使用传统的体外转染试剂(如脂质体)是没有幸福的,最好还是用专门的体内转染试剂,比如Thermo Fisher的Invivofectamine系列。一眨眼,Invivofectamine试剂已经升级到第三代。

Invivofectamine 3.0试剂是一种无动物来源成分的脂质纳米颗粒,通过尾部静脉注射,能够将siRNA和miRNA高效导入小鼠肝脏细胞。转染效果如何?专家们做过实验,将Invivofectamine 3.0试剂与针对Factor VII或PPIB的siRNA混合,以每千克小鼠体重1 mg的注射量进行静脉注射,最终实现了高达85%的knockdown。与之前的产品相比,新试剂只需更少的siRNA,即可实现有效knockdown。此外,单次注射Invivofectamine 3.0试剂/siRNA复合物后,knockdown效果可维持长达3周。想要靶向其它器官?赛默飞的科学家还进行了胰腺和脾脏的实验,取得了很好的效果。

至于它的体内毒性,专家们也曾评估过。他们在试剂注射后的多个时间点进行血液化学分析及细胞因子检测。结果表明转染后每个个体的生物标志物的水平与未注射该试剂的个体相比并没有显著差异。这表明复合物表现出极低的体内毒性。这种试剂也相当稳定,即使反复冻融4次,也不会造成性能损失。

终极武器——Neon转染系统

如果这些热门工具都不管用,那我们只能祭出终极武器——Neon转染系统。这是Thermo Fisher第二代的台式电穿孔设备,可将核酸(包括质粒DNA和siRNA)高效导入几乎任意一种动物细胞内,包括难以转染的原代细胞、干细胞和造血系统来源的细胞,同时保持高的细胞活性。

与传统的电穿孔仪不同,Neon系统并没有传说中的电转杯,而是用一个特殊的移液器吸头取代。移液器吸头内使用24K镀金电极,可形成更为均匀的电场,同时最大限度地减少温度升高和pH值变化幅度,在确保细胞高效转染的同时,也更加温和,保证细胞存活率更高。

Neon系统带有两种吸头:10 μl和100 μl,让你可根据实验要求灵活选择,而不像传统电穿孔仪那样只能转染固定量的细胞。使用Neon系统,每次最少可转染2×104个细胞,最多可转染6×106个细胞。当然,这并非绝对。若你的细胞更少或更多,也可一试,据专家介绍,有一位用户曾成功转染了5000个原代毛囊细胞。

Neon也是一个开放的系统,让用户能够单独控制每个参数。厂家也提供了一个数据库,收集各种细胞类型的建议设置,你可在这个基础上优化和调整。Neon能够对多种难以转染的细胞进行高效转染,包括原代星形胶质细胞、原代树突状细胞、Jurkat、小鼠胚胎干细胞等。多种细胞类型可获得超过75%的转染效率。

工具多了虽然是好事,但也可能带来选择困难症。好吧,那我们就送上一棵转染决策树,希望能帮助你做出明智选择吧。另外,Thermo Fisher也有一份《转染基础知识手册》,涵盖了转染基础知识、如何选择转染方法,以及如何优化转染实验等干货,实验室必备哦。立即点击索取>>。另外,如果您对上面介绍的产品感兴趣,也可以申请试用装看看,点击申请>>(生物通 余亮)

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