2015年最热门的质粒技术[创新技巧]

无论是克隆和表达、还是基因组编辑，质粒都是我们必备的工具。常用的质粒，实验室一般都有，或者隔壁实验室有，那就你有我有大家有。不过，对于基因组编辑这种新的应用，手头的质粒肯定不合适。2015年有哪些热门的质粒技术出现？Addgene最近有统计。

分裂的Cas9系统

大家都知道，Cas9蛋白是由N端的DNA识别结构域和C端的核酸酶结构域组成的。张锋的研究团队利用Cas9的这种特殊结构，设计出一系列“分裂的”Cas9分子（split Cas9），它们不能单独发挥作用，在二聚化后才能形成功能齐备的Cas9。

这种技术将野生型的Cas9分裂成N端（Cas9(N)-2xNLS）和C端（Cas9(C)-2xNLS）片段，以便实现共表达和自我组装后的DNA靶点切割。为了对基因敲除或激活有更精确的时间控制，C端的cas9片段融合了FK 506结合蛋白12（Cas9(C)-FKBP-2xNLS），而N端融合了雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的结合结构域（Cas9(N)-FRB-NES），实现了雷帕霉素诱导的基因组编辑。

在没有雷帕霉素处理时，Cas9(N)-FRB-NES片段被运出细胞核。在雷帕霉素处理后，Cas9(N)-FRB-NES和Cas9(C)-FKBP-2xNLS二聚化，流入细胞核，在那里形成有功能的Cas9分子。这个系统让用户能够对CRISPR/Cas9介导的基因组修饰和基因表达有更好的时间控制。

Zetsche et al., Nat Biotechnol. 2015 Feb 2;33(2):139-42. doi: 10.1038/nbt.3149.

光诱导的CRISPR-Cas9系统

光遗传学是一种强大的工具，它利用光来控制和监控单个活细胞，以了解它们如何工作。光活化让科学家能够从时间和空间上控制哪些基因开启或关闭。此前，科学家已经利用DNA引导的光遗传学工具成功调控基因转录；不过，让光活化的蛋白结构域到达特定位置还是蛮困难的。

为了克服DNA引导系统（如TALEN或ZFN）的许多限制，Gersbach实验室修改了RNA引导的CRISPR-Cas9系统，开发出一种快速而灵活的工具。在这个系统中，Polstein和Gersbach融合了光诱导的蛋白结构域CibN和Cry2，分别让dCas9和VP64失活。CibN和Cry2形成异源二聚体，可用蓝光活化。它们将VP64反式激活因子和dCas9定位到基因组的特定位点上，并激活转录。这种LACE技术有着许多潜在的应用。

Polstein LR & Gersbach CA, Nat Chem Biol 2015 Mar;11(3):198-200.

明亮的SunTag系统

在蛋白成像的过程中，一般的思路是将蛋白质与荧光蛋白（如GFP）融合。然而，在普通的荧光显微镜下，带GFP结构域的单个蛋白是很暗淡的，但添加太多GFP结构域又会让蛋白变得过大。于是，加州大学的研究人员开发出SunTag系统。

这个系统是一个合成的支架，最多能招募蛋白质的24个拷贝。具体而言，在目的蛋白上融合多个同源的肽段表位，之后用融合sfGFP的scFv抗体对其进行荧光标记。这个系统放大了荧光信号的强度，实现了活细胞内单分子的追踪，而不会影响蛋白质的功能。与dCas9融合后，SunTag系统也能上调基因表达。研究人员曾试过将多个拷贝的VP64招募到sgRNA靶定的基因，提高了靶基因的转录水平。

Tanenbaum et al., Cell. 2014 Oct 8. pii: S0092-8674(14)01227-6.

高效的克隆载体

新西兰惠灵顿维多利亚大学的研究人员开发出一种自适应的细菌表达载体，使克隆效率和基因表达接近100%。这种pUCXKT载体确保所有筛选的质粒都含有一个基因变异，且适用于高通量和低通量的筛选应用。这个系统能够轻松修改，以使用不同的抗生素、限制性内切酶和质粒骨架。

pUCXKT载体含有一个截短版本的卡那霉素抗性基因，缺少了最前面的两个密码子。在截短基因和启动子之间插入了两个终止密码子，以防止这种抗性的渗漏表达。与之前的系统不同，pUCXKT载体不会引起抗生素表达框与目的基因的融合翻译。

在扩增待表达的基因时，正向引物是基因特异的，含有所需的限制性酶切位点（MCS），而反向引物含有抗性基因缺少的密码子、核糖体结合位点、SacI限制性酶切位点以及一个接头区。之后将PCR产物连接到pUCXKT的MCS/SacI位点上，去除终止密码子，补上抗性基因缺少的密码子。因此，pUCXKT重组克隆就具有卡那霉素和氨苄青霉素的抗性。（延伸阅读：Nuleic Acids Res新技术：可编程的基因调控体系）

Prosser et al., Biotechnol Lett. 2015. 37:383-389.