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简单两步改善WB中膜蛋白的检测[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年11月17日 来源:生物通

摘要:

  利用Western blot,人们可精确鉴定复杂样品中的特定蛋白质。然而,每条泳道可加入的蛋白总量是有限的,这就限制了低丰度蛋白的检测。因此,低丰度蛋白需要预先富集,才能可靠检测。为此,研究人员设计了一种简单方法,从酵母细胞裂解液中富集膜蛋白,并制备SDS凝胶电泳的样品。

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生物通报道 俄罗斯科学院的研究人员近日开发出一种简单的方法,可改善免疫印迹中膜蛋白的检测。他们在新一期的《BioTechniques》上介绍了这个成果。

利用Western blot,人们可精确鉴定复杂样品中的特定蛋白质。然而,每条泳道可加入的蛋白总量是有限的,这就限制了低丰度蛋白的检测。因此,低丰度蛋白需要预先富集,才能可靠检测。为此,研究人员设计了一种简单方法,从酵母细胞裂解液中富集膜蛋白,并制备SDS凝胶电泳的样品。

为了确定汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中膜蛋白Pho87的水平,研究人员一开始用了常规的方法进行样品制备。这就是大家熟知的:用玻璃珠破碎细胞,再用Laemmli SDS凝胶电泳缓冲液煮沸细胞裂解物。尽管每条泳道的上样量相当高,但全长Pho87的条带却总是无处寻觅。相反,Pho87降解产物的条带却格外显眼。

由于Pho87是膜蛋白,研究人员便试着通过分离裂解液中的膜组分来浓缩。他们假设,在细胞破碎过程中提高盐浓度可保护Pho87免于降解,并刺激膜组分沉淀,从而有助于Pho87的富集。基于此,他们尝试了不同浓度的乙酸铵和不同的孵育时间,发现在1 M乙酸铵中孵育2小时可明显改善Pho87的沉降。

大家都知道,样品煮沸可能引起膜蛋白的聚集。同时,样品裂解液中SDS的存在可能使蛋白更容易被蛋白酶水解。事实上,即使蛋白酶抑制剂存在,研究人员还是无法在细胞裂解液中检测到全长的Pho87条带。为了避免煮沸并确保蛋白酶迅速降解,他们采用了包含SDS和高浓度尿素的样品缓冲液。

利用这种方法,研究人员检测了汉逊酵母的一些蛋白,包括Pho87、Sup35、Pmr1、CPY、Gas1、Tpd3和微管蛋白,以及酿酒酵母的一些蛋白,包括Sup35、Sup45、Gas1、Hsp104、Rnq1和微管蛋白,并将实验结果与常规方法进行了比较。

他们发现,与常规方法相比,新方法在膜相关蛋白(Pho87、Pmr1和Gas1)以及Tpd3和微管蛋白上有着更好的表现。Tpd3和微管蛋白的沉淀可能是由于它们与纺锤体极体的相互作用。同时,Tpd3的相当一部分位于细胞核中,这可能也有助于其沉淀。作者认为,将沉淀的蛋白溶解在含尿素的缓冲液中而不煮沸,大大改善了蛋白质的检测,特别是Pho87。(生物通 薄荷)

原文检索

A simple enrichment procedure improves detection of membrane proteins by immunoblotting

BioTechniques, Vol. 61, No. 5, November 2016, pp. 260–261

(http://www.ebiotrade.com/)
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