探索RNA与蛋白的相互作用，你需要这两种检测[选购宝典]

从DNA到蛋白质，这是一个相当复杂的过程。转录DNA的代码，这只是万里长征的第一步。随后，大量蛋白质编辑RNA，带领它从细胞核到细胞质，控制其稳定性，并指导其翻译。基于这一现象，许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。

从DNA到蛋白质，这是一个相当复杂的过程。转录DNA的代码，这只是万里长征的第一步。随后，大量蛋白质编辑RNA，带领它从细胞核到细胞质，控制其稳定性，并指导其翻译。

据印第安纳大学的副教授Sarath Chandra Janga介绍，数百个RNA结合蛋白（RBP）参与了这个过程。Janga正在维护一个人类RNA结合蛋白的数据库，他估计大约有3000个人类蛋白质与RNA结合，其中1400个已通过实验确认。基于这一现象，许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。

科学家有两个主要选择：核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）和紫外交联免疫沉淀（CLIP）。两者都利用RNA结合蛋白的抗体来pull down结合的RNA，不过操作方法略有不同。杜克大学医学中心的Jack D. Keene教授表示：“两种方法各有用途，也各有缺点。”Keene教授是研究RNA调控的专家，曾在九十年代发明了最初的方法。

RIP vs. CLIP

在开展RIP检测时，科学家从细胞提取物中拉下蛋白质-RNA复合物，然后利用测序来鉴定那些目标RNA。Keene喜欢这种技术，因为它能带来与RBP天然结合的一切东西。同时，它也是定量的。数据告诉我们，某个RNA结合蛋白究竟与几十个、几百个还是几千个RNA相结合。

不过，经典的RIP检测不会告诉我们，具体哪几个核苷酸在蛋白质的结合位点上；它只是鉴定出一组目标RNA。此外，据Janga介绍，它不仅仅拉下与目的蛋白结合的RNA。许多RNA结合蛋白是相互关联的，因此RIP可能拉下所有关联蛋白，以及它们当时结合的所有RNA。换句话说，在RIP检测中，A的抗体也许会收集同一复合物中与B或C结合的RNA。

CLIP则希望解决这些问题，让免疫沉淀仅限于感兴趣的RBP以及与之互作的RNA。在免疫沉淀之前，科学家利用紫外光让结合的伴侣紧密交联。然后，他们利用酶来剪切所有未受抗体保护的RNA和蛋白质。与RIP一样，科学家随后通过测序来鉴定拉下的RNA。由于大部分未交联的RNA被去除，CLIP可以鉴定出特定的结合序列。

当然，CLIP也存在一些问题。最关键的是，紫外光无法让细胞中所有的RNA-蛋白互作形成交联。这样一来，科学家必须开展试错实验以确定适当的紫外剂量，既保证重要的生物互作形成交联，又避免其他的RNA-蛋白组合来捣乱。

Keene表示：“交联的效率可能只有5%，甚至更低。你也许错过了相当一部分的结合位点。”基于这个原因，CLIP并不像RIP那样是定量的，它无法区分RNA结合蛋白与这个或那个RNA目标的相对亲和力。

产品选择

开发RIP或CLIP试剂盒的公司并不多，而Keene将他的RIP和CLIP专利授权给MBL International Corporation。这家公司提供RIP检测试剂盒、RiboTrap试剂盒以及RIP认证的抗体。

无论采用哪种技术，抗体的质量都是关键。MBL目前提供大约120种RNA结合蛋白的抗体，经过他们的精心验证，大约有50种是对RIP有效的。独立的ENCODE项目曾列出1027种适用于人和小鼠RNA结合蛋白的抗体，其中224种满足结合目标蛋白的标准。

MBL还提供另一个方向的试剂盒：从感兴趣的RNA开始，鉴定结合的蛋白质。在使用RiboTrap试剂盒时，研究人员首先利用5’-溴-UTP来合成其RNA诱饵，然后将合成的RNA与细胞裂解液共同孵育。之后，他们利用BrdU抗体来拉下RNA以及结合的蛋白，并通过质谱鉴定蛋白质。

MBL提供三种洗涤缓冲液供用户选择，以便发现RNA与RBP之间的强关联或弱关联。不过，据MBL的法规事务部主任Shinobu Kitamura介绍，强的相互作用不一定意味着它发挥关键的生物功能，弱的相互作用可能也很重要。

此外，默克生命科学也提供RIP的检测试剂盒和抗体。据介绍，EZ-Magna RIP试剂盒提供阴性、阳性对照抗体以及对照引物，特别适用于该技术的初次使用者。它还提供经过RIP实验验证的抗体，可保证最可靠的实验表现。

不过对于CLIP，只有少数实验室能真正掌握它。Janga表示，数据也许很杂乱，许多可能的RNA目标突然出现。他认为，开展重复实验会有所帮助，无论是同一样品的，还是不同样品的。“这些生物学重复和技术重复的确可以提高结果的效果和质量，”Janga说。Keene还建议用DO-RIP实验的生物学重复，至少在三个不同的时间点收集细胞裂解液。

探索RNA-蛋白质相互作用的工具仍在不断发展。供应商正与科学家合作，开发特异性更好的工具，这将帮助研究人员更好地了解RNP复合物的作用。请各位拭目以待吧。

深入了解默克生命科学的RIP检测试剂盒和抗体

（作者：Amber Dance / 生物通编译）