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探索RNA与蛋白的相互作用,你需要这两种检测[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年12月23日 来源:生物通

摘要:

  从DNA到蛋白质,这是一个相当复杂的过程。转录DNA的代码,这只是万里长征的第一步。随后,大量蛋白质编辑RNA,带领它从细胞核到细胞质,控制其稳定性,并指导其翻译。基于这一现象,许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。

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从DNA到蛋白质,这是一个相当复杂的过程。转录DNA的代码,这只是万里长征的第一步。随后,大量蛋白质编辑RNA,带领它从细胞核到细胞质,控制其稳定性,并指导其翻译。

据印第安纳大学的副教授Sarath Chandra Janga介绍,数百个RNA结合蛋白(RBP)参与了这个过程。Janga正在维护一个人类RNA结合蛋白的数据库,他估计大约有3000个人类蛋白质与RNA结合,其中1400个已通过实验确认。基于这一现象,许多科学家正在鉴定哪些RNA与哪些蛋白质相结合。

科学家有两个主要选择:核糖核蛋白免疫沉淀(RIP)和紫外交联免疫沉淀(CLIP)。两者都利用RNA结合蛋白的抗体来pull down结合的RNA,不过操作方法略有不同。杜克大学医学中心的Jack D. Keene教授表示:“两种方法各有用途,也各有缺点。”Keene教授是研究RNA调控的专家,曾在九十年代发明了最初的方法。

RIP vs. CLIP

在开展RIP检测时,科学家从细胞提取物中拉下蛋白质-RNA复合物,然后利用测序来鉴定那些目标RNA。Keene喜欢这种技术,因为它能带来与RBP天然结合的一切东西。同时,它也是定量的。数据告诉我们,某个RNA结合蛋白究竟与几十个、几百个还是几千个RNA相结合。

不过,经典的RIP检测不会告诉我们,具体哪几个核苷酸在蛋白质的结合位点上;它只是鉴定出一组目标RNA。此外,据Janga介绍,它不仅仅拉下与目的蛋白结合的RNA。许多RNA结合蛋白是相互关联的,因此RIP可能拉下所有关联蛋白,以及它们当时结合的所有RNA。换句话说,在RIP检测中,A的抗体也许会收集同一复合物中与B或C结合的RNA。

CLIP则希望解决这些问题,让免疫沉淀仅限于感兴趣的RBP以及与之互作的RNA。在免疫沉淀之前,科学家利用紫外光让结合的伴侣紧密交联。然后,他们利用酶来剪切所有未受抗体保护的RNA和蛋白质。与RIP一样,科学家随后通过测序来鉴定拉下的RNA。由于大部分未交联的RNA被去除,CLIP可以鉴定出特定的结合序列。

当然,CLIP也存在一些问题。最关键的是,紫外光无法让细胞中所有的RNA-蛋白互作形成交联。这样一来,科学家必须开展试错实验以确定适当的紫外剂量,既保证重要的生物互作形成交联,又避免其他的RNA-蛋白组合来捣乱。

Keene表示:“交联的效率可能只有5%,甚至更低。你也许错过了相当一部分的结合位点。”基于这个原因,CLIP并不像RIP那样是定量的,它无法区分RNA结合蛋白与这个或那个RNA目标的相对亲和力。

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