E.coli CRISPR/Cas9基因编辑试剂盒敲除大肠杆菌BL21菌种中的lacZ基因

CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在各种生物中实现基因组编辑。北京英茂盛业采用大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒（CR3010），实现了敲除BL21菌种中的lacZ（β-半乳糖苷酶）基因，敲除效率高达90%，实验周期不到一周。整个实验中进行合成条sgRNA靶点引物及一对鉴定引物。

实验原理：

β-半乳糖苷酶基因是大肠杆菌乳糖代谢途径中的一个酶。β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。这个反应被广泛用于基因工程中蓝白斑筛选鉴定重组质粒。通过CRISPR/Cas9编辑β-半乳糖苷酶基因，造成β-半乳糖苷酶基因功能缺失，编辑后的BL21菌种将不能代谢X-gal产生蓝斑。

实验材料：

大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒（英茂盛业，CR3010）
Clone Direct PCR Mix（英茂盛业，P3001）

实验设计：

根据BL21中β-半乳糖苷酶基因序列，设计基因敲除靶点和重组修复模板。

图一、设计方案：

 
图二、基因编辑后序列：

（请点击查看大图）

设计的引物列表：

引物名称	序列5’-3’	用途
LacZ-target	TCCTAGGTATAATACTAGTcgttttacaacgtcgtgactG TTTTAGAGCTAGAAATAGC	合成sgRNA表达框。
lacZ-JD-F	TTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT	PCR鉴定基因编辑克隆，阴性145bp，阳性119bp。
lacZ-JD-F	AGGGGGATGTGCTGCAAGGCGA
LacZ-HR-F	TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG GATTCACTGGCAAAACC	合成重组模板
LacZ-HR-R	GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA CGCCAGGGTTTTGCCAGTGAATCCG

实验步骤：

一、制备表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞

1、 pFN-Cas9载体转化BL21菌种。
制备BL21化学感受态细胞，用pFN-Cas9载体进行转化。用含amp抗性的LB平板筛选出阳性克隆。
2、 按照说明书将含pFN-Cas9质粒的BL21菌种制备为电转化感受态细胞。

二、构建pFG-sgRNA载体。

1、 插入片段PCR扩增：
扩增体系：

sgRNA-F1 primer	1μl
sgRNA-R2 primer	1μl
LacZ-target	0.5μl
PCR template	0.5μl
Clone Direct PCR Mix	25μl
H2O	22μl
Total	50μl

反应程序：
95℃      2min
95℃     10sec
60℃     15sec    10 cycles
72℃     30sec
95℃     10sec
58℃     15sec    15 cycles
72℃     30sec

琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物备用。

2、 pFG-sgRNA载体连接：

配制连接体系：

胶回收的PCR产物	0.5μl
pFG-sgRNA载体	2μl
Loop Ligation Enzyme Mix	0.5μl
Loop Ligation Buffer	1μl
H2O	6μl
Total	10μl

连接反应：
37℃      5min
16℃     10min

3、 连接产物转化dH5a感受态，挑取克隆测序。正确的质粒命名为pFG-sgRNA-lac。

三、合成同源重组模板。

1、 PCR扩增同源重组模板：

扩增体系：

LacZ-HR-F	2μl
LacZ-HR-R	2μl
Clone Direct PCR Mix	25μl
H2O	21μl
Total	50μl

扩增条件：
95℃      2min
95℃     10sec
58℃     15sec    25 cycles
72℃     30sec

乙醇沉淀回收PCR产物，定量。

四、pSG-sgRNA载体、重组模板转化表达Cas9蛋白的BL21感受态。

1、 按照下表配制转化Mix，分别电转化表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞。

组1	组2
pSG-sgRNA-lac 50ng	pSG-sgRNA 50ng
重组模板 400ng	重组模板 400ng

2、 转化产物涂含Xgal/amp/Str平板，30℃培养。
3、 挑取克隆用lacZ-JD-F/R进行鉴定。

实验结果：

1、PCR克隆鉴定实验结果：

 
2、Xgal平板显色检测结果

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