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CRISPR应用指南:选择哪一种Cas9?[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年3月1日 来源:生物通

摘要:

  CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰,能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过,目前有这么多种Cas9可供选择,你一定又开始犯愁。别急,让Addgene的专家来帮帮你。

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抑制目的基因

早期使用dCas9的实验已表明,让dCas9针对转录起始位点就足以“压制”转录。不过,在哺乳动物的细胞中,需要让带有转录抑制因子的dCas9靶定目的基因的启动子区域,才能实现可靠的抑制。如果目的基因的敲除对细胞有毒性,那么你可能需要考虑基于dCas9的抑制,包括dCas9-KRAB。Addgene提供多种质粒,抑制各个物种和细胞类型中的目的基因。

活化目的基因

基于dCas9的激活因子却是完全不同的。最简单的激活因子是指dCas9与单个转录激活域(通常是VP64)相融合。最近,第二代的激活因子也被开发出来,利用不同的方法改变基因表达。例如,“SunTag”系统通过dCas9和抗体活化融合蛋白的共表达,将多个激活域招募到同一个基因位点。Synergistic Activation Mediator复合物则包含dCas9-VP64融合和修饰的gRNA,后者能够与其他的RNA-结合转录激活因子相互作用。

下一步做什么?

如果你已经选择了适当的Cas9,恭喜你!下一步做什么呢?这里有一些注意事项,也许对你的CRISPR实验有帮助。

设计或选择一个gRNA – 对于你感兴趣的目的基因,一些公司提供了经过验证的gRNA。这些gRNA已经成功应用在实验中,并发表在同行评审的期刊上,在你刚开始着手CRISPR实验时,它们能节省不少的时间和成本。如果你的实验需要新的gRNA,那么可以选择空的gRNA载体,并利用免费的gRNA设计程序设计你的gRNA靶向序列。

不过,选择适当的Cas9只是实验成功的一半,你还需要选择适当的表达系统,并将Cas9导入目的细胞。目前市场上有各种含Cas9的质粒,可用于不同物种的表达,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物等。对于难转染的细胞,你可能需要考虑用慢病毒将Cas9导入细胞内。当然,导入mRNA和蛋白质也是另一种选择。

验证你的基因组编辑 – 一旦将Cas9和gRNA导入细胞,现在是时候确认你的目标序列是否得到了修饰。具体操作可能有所不同,这取决于特定的实验。之后我们会详细介绍。(生物通 薄荷)

 

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