董梦秋、雷晓光eLife发表重要成果

3月8日，国际著名期刊《eLife》在线发表了北京协和医学院、北京生命科学研究所（NIBS）、北京大学和清华大学等处的一项最新成果。在这项研究中，研究人员开发了一种赖氨酸靶向交联剂，以改进创新性的技术——蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（CXMS）。

　　

生物通报道：3月8日，国际著名期刊《eLife》在线发表了北京协和医学院、北京生命科学研究所（NIBS）、北京大学和清华大学等处的一项最新成果，题为“Trifunctional cross-linker for mapping protein-protein interaction networks and comparing protein conformational states”。在这项研究中，研究人员开发了一种赖氨酸靶向交联剂，以改进创新性的技术——蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）。

NIBS的董梦秋和雷晓光两位研究员是本文共同通讯作者。董梦秋研究员早年毕业于四川大学，1995年硕士毕业于中科院上海生化所，2001年博士毕业于耶鲁大学，曾经在美国加州大学圣地亚哥分校、斯克利普斯研究院从事博士后研究，2007年至今，北京生命科学研究所研究员。2012年，董梦秋实验室与贺思敏教授研究组合作，研发出了一套完整的基于高精度质谱鉴定化学交联肽段的新技术方法，这一研究成果公布在Nature Methods杂志（NIBS董梦秋组发表Nature子刊文章；专访董梦秋：学科交融，思想交融的结晶）。雷晓光研究员2001年毕业于北京大学化学系，2006年博士毕业于美国波士顿大学，曾在哥伦比亚大学从事博士后研究，2008年底全职回国，曾任天津大学药物科学与技术学院药物化学系教授，博士生导师，北京生命科学研究所研究员。有多项研究成果发表在Nature，Cell，Nat.Chem. Biol.，Angew. Chem. Int. Ed.，J.Am. Chem. Soc.，Chem. Sci.和Cell Res.等国际顶级刊物上（NIBS沈志荣、雷晓光Cell子刊发表程序性坏死研究新成果；NIBS雷晓光实验室报道天然产物首次仿生全合成）。

在不同的复合物中，蛋白质通过与多个蛋白质合作伙伴相互作用，而执行不同的功能。研究蛋白质复合物结构和蛋白质间相互作用，对于理解它们的功能是至关重要的。近年来，蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）已经成为分析这种结构和相互作用的有力工具。与传统方法相比，CXMS方法耗时少，对样品纯度要求不高；因此，这种技术受到越来越多的欢迎。

随着分析仪器发展的最新进展，交联试剂和软件，已经使CXMS从默默无闻到日益突出，并涌现出一系列成功的应用案例。然而，CXMS仍受到样品复杂性和交联肽低丰度的限制。为了降低大分子复合物包含的样本的复杂性，通常需要广泛的分馏。在更异质性的样本中（如天然免疫沉淀物和全细胞裂解液）确定交联肽，甚至更为困难。

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考虑到样品中交联肽的稀疏性，交联后使用亲和标记物将它们从复杂的混合物中纯化出来，将是有利的。然而，尽管研究人员加大了力度，开发具有富集功能的化学交联剂，但是只有很少一些药物已被证明能提高复杂样品的识别能力。

在这项工作中，研究人员开发了一系列的化学交联剂，它们具有一种之前首创的模块化设计。它们都包含一种用于亲和纯化的生物素标记物，和一个裂解位点——可用于将交联肽从链霉亲和素磁珠上释放出来。研究人员选择了具有最佳性能的交联剂，并开发了一种强大的富集程序，具有97%以上的浓缩效率。他们称之为赖氨酸靶向富集交联剂（Leiker）。研究人员利用之前开发的pLink识别软件，表明用Leiker可有效地促进各种各样样本类型的CXMS分析，从纯化的复合物、天然免疫沉淀物，到高度复杂的全细胞裂解液。

交联剂修饰的肽的定量，有可能检测到蛋白质的构象变化和分子间相互作用的变化，虽然这些方法不是很成熟。为了解决这项技术的这个潜在关键应用，该研究小组合成了稳定的同位素标记的Leiker。同时，他们构建了自动化数据分析流程，用于轻和重Leiker交联连接的相对定量。

作为一个概念验证，研究人员对一个RNA结合蛋白L7Ae，进行了定量CXMS分析。使用氘标记的Leiker，研究人员发现，正如预期的那样，在存在RNA的情况下，包埋在RNA结合的三个L7Ae赖氨酸残基，它们的单一连接大幅度下降。研究人员进一步将量化CXMS的应用，延伸到了一个高度复杂的系统，包含对数期和稳定期的大肠杆菌细胞，并鉴定了一个生长期特异性的蛋白质相互作用。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Trifunctional cross-linker for mapping protein-protein interaction networks and comparing protein conformational states
Abstract: To improve chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry (CXMS), we developed a lysine-targeted enrichable cross-linker containing a biotin tag for affinity purification, a chemical cleavage site to separate cross-linked peptides away from biotin after enrichment, and a spacer arm that can be labeled with stable isotopes for quantitation. By locating the flexible proteins on the surface of 70S ribosome, we show that this trifunctional cross-linker is effective at attaining structural information not easily attainable by crystallography and electron microscopy. From a crude Rrp46 immunoprecipitate, it helped identify two direct binding partners of Rrp46 and 15 protein-protein interactions (PPIs) among the co-immunoprecipitated exosome subunits. Applying it to E. coli and C. elegans lysates, we identified 3130 and 893 inter-linked lysine pairs, representing 677 and 121 PPIs. Using a quantitative CXMS workflow we demonstrate that it can reveal changes in the reactivity of lysine residues due to protein-nucleic acid interaction.