2016版液相色谱选购指南[选购宝典]

从溶液中分离蛋白质时，液相色谱（liquid chromatography）是最广泛使用的技术之一。这种方法的优势在于能够利用物理化学的性质，如大小、手性、疏水性、电荷或与特定配体的结合，来浓缩、脱盐或纯化蛋白。在分离过程中，细胞上清液或细菌裂解液流过柱子（其中含有树脂或填料，通常称为“固相”），以不同但可以预测的方式相互作用。

实验室规模的蛋白制备曾经是在重力流玻璃柱或自制的低压泵驱动系统上开展。最近，研究人员已经欣然接受了中低压的快速蛋白液相色谱仪（FPLC）。这些仪器利用自动化和模块化组件，以更大压力推动溶液（“液相”）流过柱子，因此速度更快。

多家供应商，如Agilent、Bio-Rad、GE Healthcare、Millipore、QIAGEN、Thermo Fisher等，提供了多元化的产品，以满足研究人员的需求。有些厂商在高压液相色谱（HPLC）和超高压液相色谱（UHPLC/UPLC）上更有优势，有些则刚好相反，主要提供FPLC/LPLC（低压液相色谱）系统。

开展层析所用的柱也是多种多样的。这份指南主要介绍亲和填料、离子交换填料及其他填料，以及在实验室中制备蛋白所用的柱子。在决定哪种试剂最适合你的研究项目时，这些信息可能用得上，同样，它也适用于放大的蛋白纯化流程。

流程

色谱可用来分析、定量和了解少量蛋白的结构，对此而言，HPLC或UPLC是最佳之选。在实验室规模的蛋白纯化中，研究人员可能希望制备几十或几百毫克的产物，用于后续研究。他们对方便和快速的要求超过了绝对纯度或产量：我多快才能从培养液中获得我感兴趣的蛋白？实验室规模无疑和生产规模不同，后续需要大量蛋白。

早在纯化之前，研究人员就应当考虑纯化策略。如果它是一个重组蛋白，可以加上亲和标签，方便纯化，即使没有标签，研究人员也可找出一些性质，以便确定最有效的填料和策略。例如，蛋白质的等电点（pI）可以帮助决定到底是选择阳离子交换还是阴离子交换柱。同样地，发现序列中的疏水区域则暗示疏水相互作用层析（HIC）可能有用。

纯化通常是从某种亲和步骤开始的，比如让上清液流过Protein G柱，或利用金属螯合柱捕获带组氨酸标签的蛋白。不过，对于大多数天然蛋白，亲和纯化并不是一种选择，在这种情况下，研究人员可能会借助更传统的技术，如离子交换（IEX）层析和疏水相互作用层析（HIC），再加上分子排阻层析（SEC，又称凝胶过滤）。在纯化流程中，这些步骤往往是依次开展的，包括捕获（capture）、中级（intermediate）和精制（polishing）步骤。

亲和填料

亲和性HPLC树脂通常是由bead组成的，琼脂糖凝胶及其衍生物最常见，其上带有功能基团，能够与感兴趣的蛋白特异结合。市场上出售带有各种配体的bead。例如，GE的《亲和层析柱和填料选择指南》介绍了预装柱和散装填料。Bio-Rad也提供在线指南，可帮助研究人员选择柱和填料。

许多亲和树脂用于基团特异的纯化，这意味着它们结合一组相关的蛋白，如某些激酶、蛋白酶或糖蛋白。这些填料常被用于纯化带有生物素、多聚组氨酸、GST或MBP标签的蛋白。

一些填料则特异识别一类免疫球蛋白或部分片段。例如，带有Protein A的树脂可在单个亲和步骤中获得95%以上的纯度。不过研究人员也可以在填料上结合自己的配体。比如，结合特定抗体以捕获对应的抗原，或用药物抑制剂来捕获它的结合伴侣。这项相互作用往往是高度特异的，但洗脱可能需要严苛的条件，这需要测试和优化，以避免蛋白变性。

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结合和洗脱的层析通常可以放大，而不需要对填料做太多改变，这是许多有望投入生产的项目的重要考量因素。这使得人们安心，因为整个过程不需要重新设计。另一个考量因素是这种放大在商业上是否可行：树脂是不是太过昂贵？抗体是不是很难获得？根据这些问题的答案，研究人员可在早期考虑更具扩展性的替代品。

由于蛋白是选择性结合的，bead大小就不太受人关注。捕获树脂往往较大，部分原因是上样的样品通常是澄清的裂解液，充满了粘稠的蛋白，这可能会阻塞比方说10 mm bead制成的柱。

亲和层析的优点之一是对样品量几乎没什么限制，只要树脂有足够的容量来吸收样品中的蛋白，其他的就会流走。结合能力通常是由厂商提供的，表示为每毫升层析树脂结合多少毫克蛋白。实际上，亲和层析不一定需要在柱中进行。少量纯化可在离心柱中进行。对于大量样品的自动纯化，磁珠也是个不错的选择。

离子交换填料

即使亲和柱再高效，也总是有一些污染物跑来凑热闹。因此，亲和纯化后往往跟着某种类型的IEX作为精细步骤。如果没有合适的亲和树脂，离子交换可作为纯化的第一步。IEX的成本比较低，容量比较大，这对捕获步骤特别重要。

IEX填料可分为两类：阳离子交换剂，它吸引带正电荷的分子；阴离子交换剂，它与带负电荷的分子结合。每一类都包括强和弱的结合剂。缓冲液条件（如盐浓度和pH）可用来改变这些树脂的结合性质。

研究人员可能先过bead较大的柱，再过bead较小的柱，或者利用电荷相反的树脂进行第二次IEX，甚至使用HIC作为精细步骤。在HIC操作中，疏水性配体在高盐浓度下与蛋白表面的疏水区域结合。在适当条件下，较小的bead能带来更高的分辨率，但对于捕获操作，这往往不是重要的考虑因素。

混合模式填料

混合模式或多模式填料也引起了人们浓厚的兴趣。不过，研究人员无法准确预测他们的蛋白质与混合模式的树脂如何相互作用，因此他们需要更多的优化。这也许是值得的，因为调整条件可以使得工艺污染物（样品中的其他蛋白）和产物杂质（如截短蛋白）更适合精细分离。

与之前介绍的其他填料不同，不同厂商的混合模式配体往往差异很大，例如，一个使用芳香族而另一个使用支链烃作为疏水元件。因此，建议你在考虑多模式填料时，尽可能多地筛选各种树脂。这样才有望获得最好的分离效果。

分子排阻填料

在这种层析中，溶液中的蛋白流经树脂。较小的分子需要更长的时间通过柱，因为它们深入小孔的程度比较大的分子更高。对于分子量存在较大差异的蛋白来说，比如单体和二聚体和多聚体，SEC是一种分离的好办法。它也适用于样品净化、脱盐和缓冲液交换。对于质谱或结晶等纯度要求高的下游应用，SEC通常作为精细步骤。

在SEC填料产品方面，许多厂商都提供了多样化的产品，具体体现在bead材料和孔径不同。例如，GE新的Superdex™ 和Superose™ Increase系列采用小尺寸的bead（10 mm），可作为FPLC和HPLC之间的桥梁，让研究人员利用低压层析系统，以近乎分析级的分辨率分离蛋白。

结语

在制备少量蛋白，用于下游的结晶、ELISA或抑制剂研究时，研究人员往往依赖层析，他们使用中低压驱动的FPLC仪器。

各种填料利用不同的物理化学性质来实现分离。亲和层析通常是首选，因为它带来了最具选择性的分离，纯度也往往最高。在纯化带电荷或疏水蛋白时，IEX、HIC和混合模式层析是下一步的选择。然而，由于不同的分子可能有着相同的电荷或疏水性，反复几次也许有必要。SEC通常作为最后的精细步骤。通常情况下，多个柱可串联使用，以达到理想的纯度。

（作者：Josh P. Roberts / 生物通编译）