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高通量核酸提取方案选择
【字体: 大 中 小 】 时间:2016年04月18日 来源:百泰克
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随着近年来分子生物学的高速发展,涌现出了一大批以核酸为基础的分子生物学实验,如二代测序、荧光定量PCR、基因芯片、核酸分子杂交等等,而DNA的完整性、RNA降解程度、核酸的纯度和浓度等都对分子生物学实验产生或多或少的影响。因此分子生物学实验首先面临的问题就是如何快速、高效、高质量的从复杂多样的样本中提取所需的核酸。
还在为堆积如山的样品发愁吗?
还在苦苦摸索样本提取条件吗?
还在研磨组织样本提取DNA吗?
还在样本消化过夜提取核酸吗?
百泰克核酸提取仪,轻松解决以上问题的困扰,让实验更轻松、更完美!
随着近年来分子生物学的高速发展,涌现出了一大批以核酸为基础的分子生物学实验,如二代测序、荧光定量PCR、基因芯片、核酸分子杂交等等,而DNA的完整性、RNA降解程度、核酸的纯度和浓度等都对分子生物学实验产生或多或少的影响。因此分子生物学实验首先面临的问题就是如何快速、高效、高质量的从复杂多样的样本中提取所需的核酸。
随着医学以及科研事业的快速发展,目前核酸提取的样本呈数量逐年递增和复杂度加深的趋势,因此为了适应核酸提取的趋势,目前市场上出现了一批高通量的核酸提取仪器,根据提取原理的不同,主要分为三类:硅介质柱法、抽吸法和磁棒法。
第一种方法:硅介质柱法
仪器的主体为离心机(真空泵)、机械臂、离心柱,依次完成裂解、结合、洗涤和洗脱过程。这种方案自动化程度是三种方案中最低的,比较适合样品量比较低,稀薄、不粘稠的样本,如少量菌液、血液等,如果样品量比较大,核酸释放量比较大,或者样品中有未裂解充分的样品,在离心过程中,极容易出现堵柱子的问题。并且样本需要预先用液氮或研磨仪充分研磨,而后多步离心,程序较为繁琐。
第二种方法:抽吸法
此方法是大型移液工作站采用的方式,仪器主体包括自动化排枪、磁板等,利用磁珠完成对核酸的吸附,而后排枪转移废液,但在转移液体过程中,底部会有液体残留,因此洗脱出的核酸盐分残留大,而且样本如果太粘稠的话,排枪在抽吸液体的时候,极有可能出现吸不动或者堵枪头的现象,因此使用范围较窄。
第三种方案:磁棒法
百泰克核酸提取仪采用此种方案,仪器主体和耗材包括磁棒、搅拌套、加热制冷模块、深孔板和底部转盘等,在进行核酸提取时,将样品加入深孔板中进行裂解,同时体系中含有磁珠,可以将裂解液中的核酸吸附到磁珠表面,此后的洗杂过程由磁棒转移带有核酸的磁珠在不同的深孔板中完成,这种方案提取的核酸盐分残留低,纯度更高,并且不会出现堵柱子和枪头的情况。
不同核酸提取方法比较
百泰克高通量核酸提取仪
设计优势:
具有24、96双通量模块,高通量、大容量模块随意选择;
震荡加热制冷提取全自动一体设计,DNA、RNA轻松提取;
触摸屏直接编程,2分钟设定程序,不依赖电脑,傻瓜式操作。
成本优势:
相对于进口仪器,在保证提取质量的前提,价格更优,性价比更高。
技术优势:
磁珠法配合磁棒设计,轻松应对组织、凝固血等粘稠样本;
创新的RNA提取流程,配合研磨仪和排枪,96个RNA样本提取只需35分钟;
独立研发配套100多种试剂,针对不同样本,全品类覆盖;
可根据用户样本定制试剂盒,真正人性化服务。
全球独一无二的组织裂解技术,组织块直接上机提取DNA(不需要研磨消化),80分钟左右得到基因组DNA,DNA长度50K以上,纯度达到二代测序、SNP、芯片等要求。对于容易降解的动物肝脏组织,胰脏组织,海洋水产样本、昆虫样品,本仪器提取效果极佳。
凝固血、促凝血、非抗凝血高通量DNA提取方案!
从全血中提取DNA应该是最基本的工作了,提取的DNA纯度、浓度以及完整性等质量直接影响了下游实验和分析。
理想状态下我们希望直接能从抗凝处理的全血中提取DNA,但实际提取过程中,我们经常会遇到凝固血的样本,与液态全血不同,凝固血样本更加难以裂解,因此怎样从凝固血中提取DNA成了许多人实验开始前最难以抉择的事情。
凝固血提取难点
凝固血难以提取核酸或者核酸提取质量不高的原因是,与液体样本不同,凝固血或者全血中含有凝固血的样本中,血细胞凝结在一起成为固态,大多数的白细胞被“困”在血凝块中,而裂解液很难将凝固血打散,无法与其中的白细胞充分接触,因此导致凝固血提取核酸十分棘手。
百泰克凝固血高通量提取方案
适用范围:促凝血,非抗凝处理的全血,未充分混匀抗凝剂导致凝固的全血
凝固血高通量核酸提取流程:
1.凝固血破碎:200μl的凝固血样本可以不破碎直接加到深孔板对应的孔位,然后直接运行操作程序即可完成提取。对于大于200μl的凝固血样本,比如1ml,2ml甚至5ml凝固血样本,需要加入凝固柱中,利用离心力将凝固血充分打散。
2.红细胞裂解:离心破碎后的凝固血中加入红细胞裂解液使红细胞破裂,离心后白细胞主要存在于底部沉淀当中,而红细胞由于细胞结构破裂而存在于上清液中,通过此步骤来去除红细胞的干扰。
3.白细胞裂解:此过程开始转移样品至核酸提取仪中,通过裂解液以及蛋白酶K的作用,使白细胞破裂,基因组和组蛋白分离,释放核酸。
4.蛋白沉淀:将磁珠富集的核酸转移至蛋白沉淀液中,使蛋白变性沉淀至深孔板底部,而核酸依旧可以结合到磁珠上,通过此步来排除核酸中蛋白的污染。
技术优势:
200μl凝固血可直接上机提取,高效便捷
中量及大量凝固血样品预处理后,可轻松提取
从十几个配方中优选出最佳的红细胞裂解液,裂解快速完全
结果稳定,纯度OD260/OD280比值为1.7-1.9,基因组完整性高达50kb-150kb,可直接用于文库构建,PCR,Southern blot等试验
得益于磁珠超高吸附表面积,核酸得率普遍高于离心柱型30%
凝固血样本,200ul样本、120ul洗脱。
序列号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
1.406 |
0.76 |
0.71 |
1.98 |
1.85 |
70.3115 |
ng/ul |
dDNA |
2 |
1.14 |
0.61 |
0.598 |
1.9 |
1.87 |
56.9862 |
ng/ul |
dDNA |
3 |
1.714 |
0.958 |
1.128 |
1.52 |
1.79 |
85.7229 |
ng/ul |
dDNA |
4 |
1.237 |
0.7 |
0.879 |
1.41 |
1.77 |
61.8409 |
ng/ul |
dDNA |
5 |
1.497 |
0.826 |
0.91 |
1.65 |
1.81 |
74.8457 |
ng/ul |
dDNA |
6 |
1.364 |
0.727 |
0.705 |
1.93 |
1.88 |
68.1756 |
ng/ul |
dDNA |
7 |
1.988 |
1.048 |
0.975 |
2.04 |
1.9 |
99.4156 |
ng/ul |
dDNA |
8 |
1.089 |
0.595 |
0.664 |
1.64 |
1.83 |
54.4653 |
ng/ul |
dDNA |
9 |
1.114 |
0.638 |
0.842 |
1.32 |
1.75 |
55.711 |
ng/ul |
dDNA |
粪便DNA高通量提取方案!
肠道含有丰富的微生物,如双歧杆菌、肠杆菌科细菌以及肠球菌等,其生物总量约为1×1014。由于肠道微生物在人体的免疫、消化吸收、肠道感染以及医院感染的发生、发展及防治方面有重要作用,因此肠道微生态被认为是人体的一个具有生理功能的器官并且成为国际研究的热点。
相比于定性研究,肠道细菌群的分子定量研究更适合于分析肠道细菌群对宿主产生的生理及病理作用。通常我们采用提取生物体粪便中的总核酸,而后通过偶联下游的PCR或者荧光定量PCR等实验来完成肠道菌群的分子生物学的鉴定以及其他方面的实验。但事实上,从粪便中提取核酸并非易事,这主要与粪便样本自身神的特点有关。
难点一
粪便中除革兰氏阴性菌外,还含有大量的革兰氏阳性菌,相比于阴性菌“纤薄”的胞壁,革兰氏阳性菌有高达15-50层的肽聚糖层,破壁难度大大升级。因此如何破壁就成为粪便中核酸提取的第一大难题。
难点二
相比于其他组织样本,粪便样本不但含高丰度的微生物,同时也含有大量的抑制物,已知的有胆红素、多种血红蛋白降解产物、植物源性多糖以及微生物的代谢产物等等,这些物质不仅会影响裂解液对微生物的破壁,而且会对下游的实验如PCR、Real-time PCR等有抑制作用,导致实验结果不准确。
百泰克高通量提取方案
技术优势:
采用独特的抽提和裂解体系迅速裂解微生物细胞壁,同时迅速灭活样品中的核酸酶
裂解液中加入蛋白酶K及溶菌酶,双重破壁,保证核酸充分释放
样品经过预处理后上机操作,不需要接触有毒试剂,同时减少了和样品的接触,更加安全
得益于磁珠超高的吸附表面积,核酸得率高于离心柱型30%
相比于离心柱和沉淀法,磁珠对蛋白的吸附效率要低很多,因此核酸中色素蛋白的污染较小,抑制物含量更低
整个操作过程较为温和,基因组完整性高,长度可达50kb以上,可直接用于PCR、Southern blot以及各种酶切反应
提取流程
样品中加入裂解液、蛋白酶K和溶菌酶,混匀后37℃水浴15min→加入溶液B,混匀后65℃水浴10min→离心10分钟取上清加入深孔板后上机操作。
粪便样品,上样量20mg左右,洗脱体积120ul。
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
2.239 |
1.37362 |
1.999107 |
1.12 |
1.63 |
111.9286 |
ng/ul |
dDNA |
2 |
1.438 |
0.760847 |
0.622511 |
2.31 |
1.89 |
71.8766 |
ng/ul |
dDNA |
3 |
1.16 |
0.637363 |
0.753247 |
1.54 |
1.82 |
57.9995 |
ng/ul |
dDNA |
4 |
0.978 |
0.531522 |
0.764063 |
1.28 |
1.84 |
48.896 |
ng/ul |
dDNA |
粪便RNA 中国疾控中心传染病所某科室 洗脱体积100ul
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
6.872 |
3.27 |
3.36 |
2.04 |
2.10 |
430.4 |
ng/ul |
RNA |
2 |
7.541 |
3.52 |
3.54 |
2.13 |
2.14 |
514.1 |
ng/ul |
RNA |
3 |
8.431 |
4.03 |
4.41 |
1.91 |
2.09 |
716.3 |
ng/ul |
RNA |
4 |
8.946 |
3.97 |
4.32 |
2.07 |
2.14 |
978.8 |
ng/ul |
RNA |
5 |
9.940 |
4.71 |
4.94 |
2.01 |
2.11 |
1005.4 |
ng/ul |
RNA |
百泰克核酸提取仪提取案例
提取小鼠肝脏组织RNA,上样量20-60mg,洗脱体积50ul,使用AU1201磁珠法组织总RNA提取试剂盒提取结果:
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
鼠肝1 |
11.005 |
5.656 |
5.723 |
1.92 |
1.95 |
440.2172 |
ng/ul |
RNA |
鼠肝 |
29.234 |
15.305 |
14.764 |
1.98 |
1.91 |
1169.358 |
ng/ul |
RNA |
鼠肝 |
29.642 |
15.438 |
15.43 |
1.96 |
1.92 |
1185.692 |
ng/ul |
RNA |
鼠肝 |
17.205 |
8.902 |
8.598 |
2 |
1.93 |
688.1863 |
ng/ul |
RNA |
鼠肝 |
11.341 |
5.892 |
6.384 |
1.78 |
1.92 |
453.6384 |
ng/ul |
RNA |
鼠肝 |
29.472 |
14.885 |
15.35 |
1.92 |
1.98 |
1178.889 |
ng/ul |
RNA |
注:OD值和胶孔顺序一致,样品梯度20-60mg.
蝌蚪组织RNA 中国生态环境研究中心某课题组,上样量10-30mg,洗脱体积50ul。
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
3.873 |
1.925 |
1.871 |
2.07 |
2.01 |
154.9 |
ng/ul |
RNA |
2 |
3.501 |
1.741 |
1.741 |
2.01 |
2.01 |
140.1 |
ng/ul |
RNA |
3 |
6.940 |
3.377 |
3.168 |
2.19 |
2.05 |
277.6 |
ng/ul |
RNA |
4 |
6.431 |
3.119 |
3.033 |
2.12 |
2.06 |
257.3 |
ng/ul |
RNA |
5 |
7.146 |
3.420 |
3.263 |
2.19 |
2.09 |
285.8 |
ng/ul |
RNA |
全血样本,200ul样本,120ul洗脱。
序列号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
1.463 |
0.797 |
1.897 |
0.77 |
1.84 |
73.1727 |
ng/ul |
dDNA |
2 |
1.32 |
0.717 |
0.779 |
1.7 |
1.84 |
66.024 |
ng/ul |
dDNA |
3 |
2.204 |
1.172 |
1.109 |
1.99 |
1.88 |
110.2237 |
ng/ul |
dDNA |
4 |
2.186 |
1.173 |
1.105 |
1.98 |
1.86 |
109.313 |
ng/ul |
dDNA |
5 |
1.571 |
0.833 |
0.809 |
1.94 |
1.89 |
78.5717 |
ng/ul |
dDNA |
6 |
1.346 |
0.721 |
0.742 |
1.81 |
1.87 |
67.2925 |
ng/ul |
dDNA |
水貂组织样品,上样量20mg,洗脱体积120ul。
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
样品类型 |
1 |
4.34 |
2.416 |
1.986 |
2.18 |
1.8 |
217.0238ng/ul |
dDNA |
2 |
4.094 |
2.273 |
1.802 |
2.27 |
1.8 |
204.7161ng/ul |
dDNA |
3 |
6.164 |
3.437 |
2.79 |
2.21 |
1.79 |
308.1867ng/ul |
dDNA |
注:OD值和胶孔顺序一致。
鱼鳍样品,上样量70mg,洗脱体积150ul。
样品编号 |
Abs260 |
Abs280 |
Abs230 |
260/230 |
260/280 |
样品浓度 |
单位 |
样品类型 |
1 |
2.7 |
1.546 |
1.404 |
1.92 |
1.75 |
134.9809 |
ng/ul |
dDNA |
2 |
4.401 |
2.487 |
2.219 |
1.98 |
1.77 |
220.0341 |
ng/ul |
dDNA |
3 |
3.34 |
1.927 |
1.795 |
1.86 |
1.73 |
166.9791 |
ng/ul |
dDNA |
4 |
4.181 |
2.339 |
2.206 |
1.89 |
1.79 |
209.054 |
ng/ul |
dDNA |
5 |
6.203 |
3.243 |
3.292 |
1.88 |
1.91 |
310.1402 |
ng/ul |
dDNA |
注:OD值和胶孔顺序一致。
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