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光遗传学+CRISPR:利用光来控制基因组编辑[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年4月6日 来源:生物通

摘要:

  作为经常上头条的明星,光遗传学(optogenetics)和CRISPR这两个技术的碰撞会产生什么样的火花?2015年,科学家结合CRISPR和光遗传学技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。

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光活化的基因组修饰

之后,Sato实验室又推出了光活化系统来切割目标DNA序列,它产生的双链断裂(DSB)可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复。这个系统的独特之处在于它利用了一种“分裂的”核酸酶。作者将Cas9分成N端(2-713个残基,N713)和C端(714-1368个残基,C714)。作者将每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合,创建了光活化的Cas9工具。

尽管作者尝试了几种不同的光活化设计,但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白,来源于真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1,包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714,显示出低背景和高的诱导活性。与全长的Cas9相比,paCas9-1识别相同的PAM,并有着相似的定位特异性。在蓝光的激发下,paCas9-1能通过NHEJ诱导插入缺失(频率为20.5%),并通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。

作者还表明,他们能够通过修改paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来取代nMagHigh1-C714,生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率,但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样,Sato实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制,并通过蓝光开关来可逆激活。

正如人们所期望的,Nihongaki等人证明,替换融合物中的Cas9结构域,也可以生成光活化的切口酶和抑制物(dCas9)。所有变异体的活性都是可逆且可重复的。

罩住CRISPR

此外,Alexander Deiters的实验室则采用了一种不同的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩(photocaging)技术,在Cas9蛋白上插入了一个可光去除的保护基团,也就是硝基苯罩住的赖氨酸(PCK)。为了在Cas9的特定位点插入PCK,研究小组使用了吡咯赖氨酰tRNA合成酶,在到达琥珀终止密码子时加入PCK。

研究人员首先检验了罩住Cas9的哪个赖氨酸能够让蛋白的切割能力更好地失活,发现是K866赖氨酸。然后,他们利用双报告基因荧光检测,证明Cas9 K866PCK突变体的确失活,而用紫外光(365nm)照射后,它显示出与野生型Cas9同样的切割活性。最后,研究人员证明,这种光罩Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。

如今,无论你想激活、抑制或修改基因,你身边都有工具,通过光来控制基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的发展,我们期待未来看到更多更酷的应用。(生物通 薄荷)

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