近年Science、Nature热门细胞研究话题大盘点

近年来，生命科学研究工具不断推陈出新，新一代的测序、成像、自动化检测等尖端技术革新了整个生命科学行业的认知维度，不仅使得经久不衰的科研话题获得新的突破，如细胞间相互作用、自噬和细胞信号通路等，同时也为一些过去无法解决的难题提供了新思路，例如癌症新疗法CAR-T。本文精选了Nature、Science等高分文献，探讨新一代的成像流式技术在如下热门话题中的应用。

免疫细胞吞噬

细胞间相互作用一直是免疫学中的热点。免疫细胞可以吞噬靶细胞从而实现自我修复的功能，也可以通过受体配体结合实现不同细胞间的物质交换。由于传统方法无法对单个细胞成像，因此细胞间相互作用的方式一直缺乏直观有效地证据。在2009年4月16日，David Sancho等人在Nature上发表了一篇题为“Identification of a dendritic cell receptor that couples sensing of necrosis to immunity”的文章，成功的证实了树突状细胞通过SKY耦合C型凝集素受体CLEC9A识别并吞噬坏死细胞，并且采用量化成像流式技术识别并量化统计的细胞吞噬的情况。

图1：通过左侧成像流式结果图可以清楚的判别细胞黏连体（’False’ postive）和发生吞噬的细胞（’True’ positive），从而排除了假阳性结果的干扰。
 
信号转导

除了免疫细胞的吞噬之外，细胞间的相互作用还包括不同细胞通过配体受体的结合进行细胞间的信号转导。最常见的是获得性免疫反应中，T淋巴细胞与抗原递呈细胞之间免疫突触的形成。在正常细胞中，与免疫突触形成相关的蛋白淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1），细胞表面抗原CD3，以及F-actin均匀分布在细胞表面；而当免疫突出形成时，这些蛋白在两个细胞接触的位置发生凝集。正是根据这一机制，2009年，Babak H. Hosseini等人成功的使用成像流式技术检测到HEL多肽处理细胞可以促进免疫突触的形成，并将科研成果发表在PNAS上。由此也证明成像流式在检测免疫突触形成中独有的优势。

图2：图2A显示，未使用HEL多肽处理的样本中LFA-1，CD3和F-actin并没有发生凝集，因此没有免疫突触形成。细胞经过HEL多肽处理后，LFA-1，CD3和F-actin并发生凝集，证明有免疫突触形成。图2B的量化统计结果显示，HEL多肽促进免疫突触形成的结果具有统计学意义。
 
自噬

自噬是细胞在演变进化的过程中保留下来的一个分解代谢过程，其主要是将胞浆内的物质运输到溶酶体内进而被分解代谢，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究自噬的传统方法主要是通过荧光显微镜或者共聚焦观察自噬小体/自噬溶酶体的形成。由于显微镜的视野限制，无法进行高通量样本或者混合细胞样本，比如临床血液样本进行分析。2012年，Kanchan Phadwal等人在《Autography》发表题为“A novel method for autophagy detection in primary cells”使用量化成像流式技术对人血中白细胞旳自噬进行了量化分析，并且通过对原代细胞和细胞系自噬的相关基因的研究，证实了T体细胞的自噬活性明显高于B细胞，而随着DNA损伤水平的升高CD8+ T细胞的自噬明显下降。从而为随着年龄的增长，免疫系统功能下降提供了合理的解释。

图3：由图可以看出，发生自噬的细胞LC3在细胞内发生的聚集，因此在细胞内，荧光信号为散点。加了抑制剂（Basal+I）后，自噬被抑制，因此LC3在细胞内是弥散分布的。

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CAR-T免疫疗法

新型抗肿瘤药一直都是各大药企的研发重点。目前临床使用的抗癌药物大多数为化学药，这类药物由于靶向性差导致患者常常会出现严重的不良反应以及耐药性。尽管药企投入了大量的人力物力，但是不得不承认传统化学类抗肿瘤药物的研发遇到了瓶颈。越来越多的科研人员把目光投向了免疫治疗，因此嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）成为科研界的“宠儿”。不幸的是肿瘤表达的大多数抗原不具备肿瘤特异性，因此大多数的CAR都以肿瘤相关性抗原作为靶点，但这往往会导致“脱靶”的可能性。同时对于相关的抗原选择也需要选择细胞表面抗原，以避免CAR-T脱靶的可能。因此寻找肿瘤特异性的细胞表面抗原成为CAR-T研究的关键。Bryan W. Day等人发现受体酪氨酸激酶在多形性胶质母细胞瘤（GBM）病人中EphA3过表达并且通过调节有丝分裂原激活蛋白激酶信号通路减少肿瘤细胞的分化。幸运的是，作者通过量化成像流式技术检测到EphA3为细胞膜蛋白，这一发现为后续的CAR-T研究提供了潜在的治疗靶点。

图4：由成像流式图像可以看到标记荧光的EphA3的分布区域，主要在细胞膜上，且在Integrin α6和CD133阳性的细胞中高表达。 对这些细胞进行统计学分析，证实EphA3高表达是有统计学意义的。

尽管传统化学类抗肿瘤药物的研发遇到了瓶颈，但是由于化学修饰相对简单方便，并且经化学修饰过的抗原抗体特异性和亲和力都会有所提高；因此，在CAR-T的研究中化学修饰依旧有着很大的应用潜力。耶鲁大学的Patrick J. McEnaney等人设计合成了一类被称为“synthetic antibody mimics targeting prostate cancer (SyAM-P)”的化合物，这类中等分子量（~ 7000 Da）的化合物同时具有抗体的结合与效应能力，因此可以有效的将免疫细胞和前列腺癌细胞特异性地结合在一起，从而增强免疫细胞对癌细胞的特异性识别和吞噬。这一发现于2014年12月16日发表在化学类的权威杂志JACS上，为CAR-T的研究提供了新思路。

 

图5：通过成像流式可区分发生吞噬的细胞，吞噬形成图（右下）显示SyAM-P可以帮助免疫细胞识别癌细胞；吞噬完成图（右上）证明免疫细胞可以吞噬癌细胞。左图量化分析显示此结果是有统计学意义。

综上所述，我们不难发现，单一的图像或者单一的群体统计学数据已经无法满足科研的需要。尤其是在精准医疗飞速发展的时代，科学家们要获得质量更高、更为可信的数据，为临床的诊断和治疗提供有力的支持。因此不仅需要科研工作者们将个体数据与群体数据的有机结合，还要通过“眼见为实”的图像证实所获得的统计学结果是有意义的。量化成像流式技术将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息，这预示着该技术在未来科研领域中无限的应用潜力！

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参考文献：
1. Sancho, D., et al., Identification of a dendritic cell receptor that couples sensing of necrosis to immunity. Nature, 2009. 458(7240): 899-903
2. Hosseini, B.H., et al., Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(42): 17852-7
3. Phadwal, K., et al., A novel method for autophagy detection in primary cells. Autophagy, 2012. 8(4): 677-689
4. Day, B.W., et al., EphA3 Maintains Tumorigenicity and Is a Therapeutic Target in Glioblastoma Multiforme. Cancer Cell, 2013. 23(2): 238-248
5. Bezbradica J.S., et al. A role for the ITAM signaling module in specifying cytokine-receptor functions. Nature Communication, 2014. 15(4): 333-342
6. McEnaney P.J. et al. Chemically Synthesized Molecules with the Targeting and Effector Functions of Antibodies. JACS, 2014. 136: 18034 - 18043.

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