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让基因组测序绕过PCR扩增[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年5月5日 来源:生物通

摘要:

  在基因组测序中,PCR扩增似乎是绕不过去的一步。然而,PCR也带来一些问题,包括不均匀扩增,导致某些序列的比例过高。对目前的新一代测序(NGS)平台而言,测序某些碱基组成上存在严重偏向的基因组区域仍是一大挑战。在GEN杂志上,Patricia Fitzpatrick Dimond博士介绍了PCR-Free的基因组测序。

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在基因组测序中,PCR扩增似乎是绕不过去的一步。然而,PCR也带来一些问题,包括不均匀扩增,导致某些序列的比例过高。对目前的新一代测序(NGS)平台而言,测序某些碱基组成上存在严重偏向的基因组区域仍是一大挑战。在GEN杂志上,Patricia Fitzpatrick Dimond博士介绍了PCR-Free的基因组测序。

文库制备的变革

2009年,Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介绍了一种无需扩增的Illumina文库制备方法(Nature Methods 2009;6:291–295)。他们表示,GC偏向的基因组的定位和组装有所改善。这种方法采用簇扩增步骤来富集完全连接的模板链,降低了重复序列的发生率,改善了序列定位和SNP检出。

这种方法的核心是采用no-PCR接头,它们包含额外的序列,让模板能够与流动槽表面直接杂交,这样就不再需要PCR步骤。作者表示,通过此方法产生的DNA模板量低于PCR方法,但定量研究表明,从5 μg起始DNA中获得的文库足够400个GA通道的测序,这满足了大多数的实验需求。此外,由于省去了PCR步骤,这种方法比标准的文库制备更快。

Illumina的产品经理Rooz Golshani表示:“我们的PCR-free产品,TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit,是金标准,也是产生最完整基因组的最佳方案。”Golshani博士指出,研究人员在需要避免PCR相关的偏向时,往往采用此试剂盒来制备文库。

2015年,J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出,随着全基因组测序被广泛用于人类微生物组研究,研究结果往往被证明是冲突或不确定的(Proc Natl Acad Sci USA 2015;10;112:14024-9)。

研究人员开展定量和定性分析来比较WGS宏基因组数据。他们采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系统。研究表明,这四种不同的NGS文库制备导致分类出现明显差异。根据分析的结果,他们建议从事微生物组研究的研究人员采用PCR-free的方法来减少PCR偏向,从而获得更准确的分类信息。

纳米孔测序

这些PCR-free的技术都是针对Illumina的测序仪开发的,不过,一种颠覆性的测序技术已经彻底改变DNA测序的方式,这就是纳米孔测序。

Oxford Nanopore Technologies开发的手机大小的MinION测序仪有望最终抛弃PCR。它读取长的DNA片段,不过目前仍需要文库制备。这种方法在分辨重复序列或单体型上具有优势,因为单个测序片段就能跨越含糊不清的区域。未来,这种设备有望用于实时医疗诊断和法医检验。

不过,英国研究人员认为,在广泛采用MinION之前,需要评估其通量和准确性(Biomol Detect Quantif 2015;3: 1–8)。他们利用MinION对三个细菌基因组进行重测序,这些有着不同的核苷酸组成。研究人员发现,MinION碱基检出后的错误率为38.2%。读长平均值和中值分别为2 kb和1 kb,而最长的序列达到98 kb。作者认为,尽管错误率限制了MinION的竞争能力,但是与Illumina MiSeq的数据相结合,MinION的序列数据可增强de novo组装。

随着MinION的试用报告不断出炉,人们发现,MinION本身也能做很多事情。它能可靠地测序小型基因组,如细菌和酵母。它也能区分亲缘关系很近的细菌和病毒,读取人类基因组中的复杂区域,并区分一对染色体上的两个基因版本。此外,传染病检测也有望成为这种手持式测序仪的一大应用。(生物通 薄荷)

原文检索

PCR-Free Genome Sequencing

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