富集微囊泡需要考虑这四个因素[心得点评]

【字体: 时间:2016年05月09日 来源:生物通

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  尽管目前还没有标准化的方法,但研究人员已开始采用各种方法来分离EV。一项调查表明,2014年许多研究人员采用超速离心,但到了2015年,大多数采用蔗糖梯度密度离心。同时,人们也开始鉴定EV,包括用Western blot检测阳性和阴性的EV标志物。富集微囊泡需要注意些什么?Amedeo Cappione III博士和Chandreyee Das博士近日在GEN上谈了四个因素。

近两年,外泌体(exosomes)和微囊泡(microvesicles)一直是研究的热点,因为它们就像小货车,协助运输各种RNA、蛋白和脂类分子,参与了细胞之间的通讯。为了了解这些小货车及其货物,研究人员首先需要制备出纯度高的EV。

尽管目前还没有标准化的方法,但研究人员已开始采用各种方法来分离EV。一项调查表明,2014年许多研究人员采用超速离心,但到了2015年,大多数采用蔗糖梯度密度离心。同时,人们也开始鉴定EV,包括用Western blot检测阳性和阴性的EV标志物。富集微囊泡需要注意些什么?Amedeo Cappione III博士和Chandreyee Das博士近日在GEN上谈了四个因素。

1. 样本的来源是什么?

细胞培养上清液。如果EV的来源是细胞培养上清液,那么制备时有很多选择。最流行的方法之一是密度梯度超速离心。操作方法是将预澄清的细胞培养上清液覆盖在蔗糖或碘克沙醇密度梯度介质中。以100,000 x g超速离心2-3小时,接着洗涤,可获得>1 g/mL的EV,且纯度相对较高。

对细胞培养上清液而言,亲和纯化也是一种相当有效的方法,它利用针对囊泡特异蛋白的抗体,如anti-CD63、anti-CD9或anti-MHC磁珠。不过,目前缺乏有效的方法从固相上洗脱EV,这主要用于表面分型和货物分析。

分子排阻纯化,如超滤、切向流过滤或层析,也是富集囊泡的一种简单而经济的方法。尽管确切的产量和纯度可能因细胞类型和培养条件而异,但一些研究表明,现代的超滤系统可能比密度梯度方法更快、更高产。另一个优点在于,超滤装置能进行缓冲液更换和样品浓缩,那么纯化出的组分可轻松满足下游分析平台的要求。

血清、血浆和脑脊髓液(CSF)。几乎所有体液中都发现了EV,比如血液、母乳、胆汁和滑液。通常来说,体液比细胞培养上清液更加粘稠。因此,这些样本应当稀释,并以更高的速度离心更长时间。如果选择超滤方法,小心未稀释的生物样本可能会堵塞滤膜。请注意,一些市售的囊泡纯化试剂盒未必能用于这些生物样本。在使用任何试剂盒之前,请阅读使用说明书。

2. 你希望通过囊泡制备获得哪些信息?

如果制备EV只是为了获得RNA图谱或蛋白信息,那么一定程度的EV膜损伤(因超速离心的剪切力引起)也是可以接受的。电荷中和(盐析)所产生的EV适合转录组分析,但不适合其他分析,因为它们可能被非EV蛋白所污染。与传统的超速离心和聚合物沉淀相比,密度梯度超速离心显示出最一致的RNA图谱。

如果你的目标是富集EV,用于治疗或分析其功能,那么最好选择更温和的技术,比如切向流过滤(TFF)和密度梯度超速离心。这些方法有望保留膜以及生物活性。

人们已经利用连续性超滤(SCUF)方法,从异质性的微囊泡中成功分离exosomes(约30 µm的EV)。这两个组分的蛋白图谱完全不同,而且在Boyden小室分析中表现出不同程度的侵袭性。

在根据大小来富集EV时,一个潜在的问题是囊泡可能大小相同,但有着不同的功能和生物来源。因此,根据表面标志物来富集EV是一个相对可靠的选择。如此看来,亲和纯化方法是最有前景的富集技术,只要EV能从固相上有效洗脱。

3. 你是否能忍受非EV组分的干扰?

在聚合物沉淀的方法中,非EV颗粒可能与EV同时纯化。对于其他方法,即使用无血清培养基,也可能产生含有非EV蛋白的组分,如白蛋白、脂蛋白、argonaute复合物等。EV样本还含有大量的脂类,它们也可能干扰总蛋白的定量。这些组分的鉴定可能需要一些特殊的蛋白分析,比如基于红外的定量,或基于磁珠的流式细胞定量。将蛋白分析与相对定量结合,可以产生蛋白浓度与EV数量的比例。如果这个比例太高,可能说明一些高丰度蛋白被同时纯化。

4. 你如何精确控制实验参数?

在富集EV的过程中,你需要控制样本收集和处理的温度、时间、速度和细胞健康参数。国际细胞外囊泡协会(ISEV)已经发布了参考标准,来判断杂志上报道的EV制备方法是否真的含有功能性EV。这些标准要求详尽的EV分离实验方法,包括报告细胞的来源和活力。

未来的方向

考虑到EV的异质性及其性质的微小差异,人们现已开发出许多新的技术来分离EV,包括微流体、电渗析,以及免疫亲和捕获后洗脱。此外,那些过去被认为是“金标准”的方法也可能需要进一步优化。改变超速离心的速度有望改变EV的组成,而亲和方法的优化能进一步区分EV的亚型。幸运的是,EV研究人员和开发人员之间的紧密合作已经促进了EV富集方法的发展。(生物通 余亮)

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