单细胞质谱流式细胞技术入门

【字体: 时间:2016年06月13日 来源:生物通

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  生命科学中的技术往往会朝着两个方向发展,其一就是增加细胞特征分析数量,用以同时分析细胞的不同特点,其二就是增加分析的分辨率,从而提高观测精确水平。近几十年里,流式细胞技术的发展满足了这两个要求,精确分析单个细胞的多种特征,帮助科学家们了解复杂或多级细胞系统中的分子机理。

生物通报道:生命科学中的技术往往会朝着两个方向发展,其一就是增加细胞特征分析数量,用以同时分析细胞的不同特点,其二就是增加分析的分辨率,从而提高观测精确水平。近几十年里,流式细胞技术的发展满足了这两个要求,精确分析单个细胞的多种特征,帮助科学家们了解复杂或多级细胞系统中的分子机理。

近期研究人员将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起,发展出了质谱流式细胞技术(mass cytometry),这种融合技术能在单细胞水平上同时分析超过40种细胞参数,极大的增加了流式细胞分析评估复杂细胞系统和过程的能力。Cell杂志发表题为“Mass Cytometry: Single Cells, Many Features”综述,介绍了质谱流式细胞技术目前的现状,相关的仪器,主要涉及的应用范围,以及数据分析方法,和未来的发展前景。

单细胞分析

在每年Nature Methods盘点的年度技术中,总是会出现单细胞或者单分子之类的技术,这是因为培养基或者机体中的细胞存在多样性,或者说是异质性,这为许多实验分析造成了障碍。可以说,随着现代生物学的发展,“平均值”这个词已经不能满足我们的需要了,我们要了解细胞之间的差异性,单细胞研究应运而生。

但是要进行单细胞分析困难重重,从技术上说也存在几个方面的问题。首先无论是针对一个特异性大分子,还是在OMIC水平上进行分子分析,都存在单细胞提取物数量少,难以分析的困难,这甚至可以说是不可能完成的,因此增加灵敏度势在必行。

质谱流式细胞技术

Mass Cytometry简单来说,就是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力,是流式细胞技术一个新的发展方向。

我想了解Fluidigm 质谱流式技术的详细信息

来自多伦多大学和斯坦福大学的研究人员曾发表题为“Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum”的文章,用同位素标记抗体,结合质谱分析的方法实现了同时对细胞表面多达一百种标记物的检测。

通常采用的荧光抗体标记细胞表面蛋白结合流式细胞术检测的方法,虽然能实现细胞分选,但只能够同时识别6-10种不同颜色的荧光,且还需尽量避免发生荧光重叠。而这项研究通过这个可以称为大量细胞计数法的方法,观察了人类骨髓产生的不同形态细胞中及表面的34种物质,不但能正确归类10多种不同类型的免疫细胞,还能观察到各类免疫细胞的内部变化,从而预知可能发生的变化。这将有助于更快更广泛的测量处方药对人体细胞的反应及功效,提前发现细胞病变,研发出针对个人的治疗药物。

基本原理

质谱流式细胞技术的核心当然就是两种实验平台的融合了:流式细胞技术与质谱技术。目前质谱流式细胞技术采用的仪器是CyTOF(Cytometry by Time-Of-Flight),其原理简单来说是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术,既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力。

传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术相比,主要有两点不同:第一、标签系统的不同,前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签,后者则使用各种金属元素作为标签;第二、检测系统的不同,前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段,而后者使用ICP质谱技术作为检测手段。


此后的CyTOF2也有改进,比如ICP质谱装置具有非常宽的原子量检测范围(88~210Da),因此可以同时检测上百个不同的参数;采用新概念的金属标签抗体,金属离子通过多聚螯和物共价的结合在抗体的不变区。由于细胞本身不含这些作为标签的金属元素,所以没有传统流式的“自发荧光”,信号背景极低。(质谱流式技术——蛋白水平的单细胞技术

在质谱流式细胞实验进行过程中,首先要将目标细胞放在亲和试剂混合物(最常见的是抗体)中温育,这些亲和试剂之前是通过螯合基团聚合物链共轭连接上纯化过的稳定重金属同位素。这些探针绑在细胞中靶标上,可以作为靶标表达水平的报告因子,然后细胞进入单细胞悬浮培养雾化,也就是让细胞进入液滴,从而导入到质谱流式细胞仪中。

进入到质谱流式细胞仪中后,细胞会穿过一个氩等离子体,在那里,共价键会断裂,产生自由原子,并完成充电过程。这样得到的离子再穿过一个四极杆,去除常见的生物元素,富集重金属报告离子,在飞行时间质谱仪中根据质荷比进行分离。离子计数再转换为电信号,最终变成一组数据,用于之后的分析。

局限性

虽然通过质谱流式细胞技术可以同时分析许多的细胞过程,但这种技术平台也存在一些局限性,在设计实验的时候要考虑到。

由于细胞需要雾化和电离,因此分析后是无法恢复其细胞活性的,而且由于质谱仪中离子飞行动力学,质谱流式细胞仪的通量要低于荧光分析仪器,同时质谱报告因子的敏感度也会下降,量子荧光团(如phycoerythrin)越多,就越难以检测低水平表达的分子特征。

推荐论文

Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum

2012年,多伦多大学和斯坦福大学采用同位素标记抗体,结合质谱分析的方法实现了同时对细胞表面多达一百种标记物的检测。

通常采用的荧光抗体标记细胞表面蛋白结合流式细胞术检测的方法,虽然能实现细胞分选,但只能够同时识别6-10种不同颜色的荧光,且还需尽量避免发生荧光重叠。

而这项研究通过这大量细胞计数法的方法,观察了人类骨髓产生的不同形态细胞中及表面的34种物质,不但能正确归类10多种不同类型的免疫细胞,还能观察到各类免疫细胞的内部变化,从而预知可能发生的变化。研究人员利用这一可以追踪单细胞多达45种(潜在性的100种或者更多)的技术观察了人类骨髓产生的不同形态细胞中及表面的34种物质。而且更为重要的是,研究人员不但能正确归类10多种不同类型的免疫细胞,还能观察到各类免疫细胞的内部变化,从而预知可能发生的变化。

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Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells

哈佛医学院Marc Kirschner等人开发了两种方法,能利用微珠将大量不同的DNA条形码同时传送到几十万纳米大小的液滴中。这些方法都利用了微流体装置来将细胞和微珠一起装入这些液滴中。这些液滴是在一个小型装配线上生成,沿着一根头发宽的槽道流动。

这两种技术分别为Drop-seq和inDrops。通过Drop-seq或inDrops运行一个批次的细胞,科学家们就可以看到整个样本中表达了哪些基因——并可以按每个细胞进行排序。

目前如果要生成96个单细胞表达谱,成本为一天数千美元。相比之下,Drop-seq每天只需6.5美分就可生成1万个单细胞表达谱。两篇Cell文章:廉价的单细胞基因表达分析新技术

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来自苏黎世大学与苏黎世联邦理工学院的研究人员开发出了一种新方法成功综合分析和显影了来自患者样本的肿瘤细胞。

这项技术以医院常规使用的一些方法为基础,采用一些抗体标记非常薄的组织切片上的生物标记,抗体偶联上纯金属同位素,这样就无需染料采用纯金属同位素来显影生物标记物,避免了生物样本分析中颜色数量有限这一问题。而且这种方法有可能确定哪些细胞受到了什么影响及其影响的程度。通过这种方法可以精确找到控制系统的弱点,这有助于开发一些新的治疗方法。

A Continuous Molecular Roadmap to iPSC Reprogramming through Progression Analysis of Single-Cell Mass Cytometry

来自美国斯坦福大学医学院的研究人员,借助于质谱流式细胞技术进行分析,对细胞重编程的动态变化过程有了更全面的认识。作者指出,这样得到的结果与传统的荧光流式细胞术基本相同,但可让我们每秒钟在大约500个细胞中同时测量40多种不同的参数。使用质谱流式细胞技术,该研究小组在重编程的第一个3到4周,分析了三个不同的重编程细胞系。对质谱流式细胞技术数据集进行的时间分辨、高维进展分析,可促进连续的重编程分子图谱的构建。本研究所描述的这种方法和数据集,为重编程优化和其他细胞重编程机制研究、以及随时间动态变化的复杂细胞群研究,提供了宝贵的资源。

(生物通)

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