两篇Nature Biotechnology聚焦CRISPR基因组编辑新工具

　　

生物通报道  在2015年发表于Cell杂志上的一项研究中，哈佛-麻省理工Broad研究所的张锋及其同事们报告称发现了一种不同的CRISPR系统：CRISPR–Cpf1，其有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。自此之后，这一CRISPR基因组编辑新型工具吸引了世界各地实验室的广泛注意（张锋Cell：新一代CRISPR基因组编辑系统 ）。

2016年4月20日，来自哈尔滨工业大学、清华大学的研究人员报告称，他们获得了Cpf1/CRISPR RNA复合物的晶体结构。这一重要的研究成果发布在Nature杂志上（哈尔滨工业大学Nature发表CRISPR研究重要成果 ）。同日，德国马克思普朗克感染生物学研究所和瑞典于默奥大学的Emmanuelle Charpentier教授领导科学家们在Nature杂志上的一篇研究论文中，描绘了一种新型细菌CRISPR-Cpf1系统的分子细节，这为实现其他的基因编辑应用，如平行靶向多个基因打开了可能的途径（CRISPR先驱Nature解析新一代CRISPR系统 ）。4 月21日，张锋领导Broad研究所的研究人员揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。这一研究成果发布在Cell杂志上（张锋Cell发表CRISPR研究新成果 ）。

现在，韩国基础科学研究院（IBS）基因组编辑中心在6月6日的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上同时发表两篇研究论文，证实了Cpf1作为一种不会引发意外突变的精确基因组编辑工具具有的优势。

作为一种CRISPR基因组编辑新工具，因为具有一些不同于Cas9的独特特征Cpf1已引起人们极大的兴趣：它只需要一条单链RNA，CRISPR RNA装配更简单；它交错的切割模式使得用所需序列替代现有序列变得更容易；相对于Cas9识别富含鸟苷的序列，Cpf1可识别较少探索的富含胸苷的DNA序列。总之，Cpf1有望拓宽CRISPR基因组编辑靶位点范围并提高效率。

尽管Cpf1有着巨大的潜力成为一种强大的基因组编辑工具，却很少有研究阐明这一新工具寻找其靶点的情况。在两篇新研究论文中，研究人员证实了Cpf1作为一种高度特异的可编程工具适用于精确的基因组编辑，并报道称利用CRISPR-Cpf1构建出了突变小鼠。

研究人员利用了Cpf1家族蛋白中最有效的两种蛋白AsCpf1和LbCpf，并完成了Digenome-seq测试：他们设计出这种方法来鉴别研究人员希望Cpf1在整个基因组中进行切割的目的（在靶）及意外（脱靶）位点。采用预装配的重组Cpf1 RNPs切割从人类细胞中分离出的无细胞基因组DNA，然后进行全基因组测序。比对序列读取，计算鉴别出了对应的打靶和脱靶体外切割位点。

全基因组分析结果显示Cpf1高度特异，相比Cas9显示较少的脱靶切割位点（LbCpf1为6个，AsCpf1为12个），切割了人类基因组中>90个位点。具体说来，在大多数体外切割位点，代表脱靶效应的插入缺失（indels）频率低于0.1%，远低于在靶位点的插入缺失频率，表明两种Cpf1蛋白几乎没有脱靶效应。“值得注意地是，靶向某一位点的LbCpf1和AsCpf1只切割了整个人类基因组中的一个在靶位点，”共同第一作者KIM Daesik说。

“为了减少脱靶效应，我们将预装配Cpf1 RNPs引入细胞中，假定与Cas9 RNPs相似，Cpf1 RNPs将会在转染后立即切割靶位点，并很快被内源性酶快速降解，由此在不牺牲在靶效应的情况下减少了脱靶效应，”两篇论文的通讯作者、IBS中心主任KIM Jin-Soo说。的确，Cpf1 RNPs没有诱导足够高到在脱靶位点生成突变的插入缺失。

为了证实Cpf1显著的特异性，来自IBS中心的另一个研究小组成功将Cpf1 RNP介导的突变带到了小鼠胚胎中。研究人员靶向了Foxn1（调控免疫系统，包括皮肤毛发生长的一个转录因子）和Tyrosinase（催化生成黑色素的一种酶）。

研究的第一作者HUR K Junho说：“数据显示Cpf1 RNP传送到小鼠胚胎中导致分别以64%和33%的高突变率敲除了目的遗传功能。我们将突变小鼠胚胎移植到代孕母鼠体内，获得了具有定向突变的小鼠。这些突变分别导致了小鼠无发及白发。为了调查Cpf1是否具有脱靶效应，我们利用分离自Foxn1突变小鼠和野生型同胞的基因组DNA进行了全基因组测序。序列分析结果显示没有发生脱靶突变。对其他突变的靶向深度测序也显示没有脱靶突变。”

在这项研究中，研究人员利用了电脉冲让Cpf1 RNPs同时进入到50个小鼠胚胎中。这种新电穿孔方法传送了生成突变动物需要的基因组编辑分子。相比于传统的显微注射法，电穿孔方法简便易行、快速且具有扩展性。

添加Cpf1进入它的工具箱，CRISPR编辑技术可以构建出更加多样的小鼠模型。KIM Jin-soo说：“由于两项研究证实了Cpf1优越的特异性，这一新核酸酶将更广泛的用于精确基因组编辑，而不会产生意外突变。从诸如无毒抗癌药物等治疗方法、干细胞治疗到高附加值的牲畜和农产品，CRISPR Cpf1的应用将不受限制而保持开放。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

Daesik Kim, Jungeun Kim, Junho K Hur, Kyung Wook Been, Sun-heui Yoon & Jin-Soo Kim. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1. Nature Biotechnology, June 2016 DOI: 10.1038/nbt.3609

Junho K Hur, Kyoungmi Kim, Kyung Wook Been, Gayoung Baek, Sunghyeok Ye, Junseok W Hur, Seuk-Min Ryu, Youn Su Lee & Jin-Soo Kim. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology, June 2016 DOI: 10.1038/nbt.3596