中国医学科学院：CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选新成果

　　

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生物通报道：CRISPR/Cas9-sgRNA(single guide RNA)全基因组文库筛选技术是在哺乳动物中进行系统基因组分析的有力工具. 来自中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所等处的研究人员通过在人急性单核白血病细胞系THP1上优化CRISPR/Cas9-sgRNA人类全基因组慢病毒文库感染体系, 构建裸鼠皮下移植肿瘤模型, 并通过优化测序建库方法, 对肿瘤组织进行二代测序以及利用生物信息学分析获得筛选结果，这项工作为在其他白血病细胞系或原代细胞上的筛选应用奠定了一定基础.

大规模基因筛选为剖析生物学过程和人类疾病中潜在的基因功能和通路提供了重要的工具, 然而全基因组基因筛选的低通量特点使在二倍体多细胞生物上得到全基因组纯合子突变文库耗时耗力. RNA干扰(RNA interfere, RNAi)技术在过去数年是功能基因组学采用的主要方法, 然而RNAi技术也具有其内在局限性, 一方面这种转录后水平对靶基因表达的抑制通常不能充分解释敲除表型, 另外也存在对其他mRNA 的脱靶效应.

近几年, CRISPR/Cas9系统已逐渐成为在多种模式生物的靶基因位点引入双链断裂(double strands break, DSB)的强大工具, 该系统包括sgRNA和Cas9核酸内切酶两种组分. 17~20 bp 的sgRNA特异地与靶向序列通过Watson-Crick碱基配对结合, 继而引导Cas9到达基因组特定区域进行DNA切割, 断裂的DNA双链可通过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)进行有效修复. NHEJ修复导致基因编码区发生插入或缺失(insertion-deletion, Indel)突变, 进而引起移码或终止密码子的提早出现, 导致基因敲除. 因此, 这项技术使得在全基因组规模上构建敲除载体十分简便, CRISPR/Cas9 文库为在人类等哺乳动物细胞上进行大规模敲除筛选开创了一个功能基因组学研究的新时代.

目前, 利用CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选已在多种细胞系及原代细胞上被用于毒性基因筛选、耐药基因筛选等, 但是在白血病中的研究还不多.

这项研究选择THP1细胞, 利用研究组构建的包含54489个sgRNA、靶向18163个人类基因的CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库, 筛选该类AML中功能性促癌或抑癌基因. 研究主要通过优化条件以提高筛选效率, 并且摸索适用于此种文库筛选所需的PCR产物文库构建方法以获得高质量的二代测序数据, 从而建立起可行的CRISPR/Cas9- sgRNA 全基因组文库筛选体系, 以用于白血病功能性促癌/抑癌基因的筛选.

研究裸鼠肿瘤模型表明, 感染sgRNA文库后的THP1细胞成瘤能力下降, 推测可能与某些促癌基因的敲除有关; 通过对二代测序数据进行生物信息学分析得到了一些候选基因. 实验结果表明, 在人单核细胞白血病细胞系上进行CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选是可行的, 这项工作为在其他白血病细胞系或原代细胞上的筛选应用奠定了一定基础.

作者指出，CRISPR-Cas9文库筛选技术有许多优势. 此前研究人员曾利用“小鼠全基因组CRISPR 敲除文库A”(mGeCKOa), 以及Cas9 DNA切割酶对来自非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)小鼠模型的细胞进行处理, 随后将这些细胞移植到小鼠体内, 发现用这一基因敲除文库处理的一些细胞形成了高转移性肿瘤. 利用新一代测序鉴别出了在原发肿瘤及转移灶中敲除的基因, 其中包含一些在人类肿瘤中众所周知的肿瘤抑制基因, 包括PTEN, CDKN2A和NF2, 也涵盖了一些从前未与癌症关联的基因.

但与此同时, 体内筛选受到许多因素的影响, 如文库的复杂性、病毒感染或细胞移植的限制性、细胞在动物体内与其他细胞相互作用的复杂性等, 因此, 在不同的细胞系或原代细胞上进行筛选体系优化是很有必要的, 这使得在THP1细胞系上的筛选体系优化对其他类似白血病细胞系的基因组研究具有一定指导意义.

（生物通）

原文检索：

陈晨, 郝莎, 白杨, 等. CRISPR/Cas9-sgRNA 全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化. 中国科学: 生命科学, 2016, 46: 839–850
Chen C, Hao S, Bai Y, et al. CRISPR/Cas9-sgRNA screening system in THP1 cell line for functional oncogenes and tumor suppressorgenes. Sci Sin Vitae, 2016, 46: 839–850, doi: 10.1360/N052016-00148