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DNA甲基化分析:重亚硫酸盐转化之华山论剑[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年8月2日 来源:生物通

摘要:

  如果你不想把时间浪费在漫长的摸索中,商业化试剂盒的确是理想的选择。这些试剂盒经过专业团队的精心打磨,在性上都有一定的保证。那么,几种重亚硫酸盐转化试剂盒在实战中的表现谁更强呢?为了选出后继实验采用的试剂盒,塞浦路斯一个研究团队开展了一场华山论剑式的试剂盒比较。

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生物通报道:表观遗传学修饰可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的活性、改变表型,对于人类发育、人类疾病和环境影响有深远的意义。表观基因组已经成为了生命科学研究的一大热点。DNA甲基化是其中研究得最深入的一种表观遗传学修饰,广泛参与了细胞对基因表达的控制,在细胞生长、细胞分化起到了关键性作用。

DNA甲基化检测在很多领域也有着意想不到的应用,例如:从母体外周血中检测游离的胎儿DNA是最受追捧的产前非侵入性诊断胎儿遗传缺陷的方法,可怎样才能确切区分母体血浆中的DNA是来自胎儿还是母体本身?根据母体和胎儿DNA的甲基化模式差异来区分,就是很有前景的一种方法,从2002年起已经发现多个能区分母体和胎儿游离DNA的差异甲基化区域(DMR),卢煜明团队率先采用重亚硫酸盐转化结合其他方法,成功区分并定量母体血浆中的胎儿游离DNA含量。此外,癌症患者血浆中肿瘤特异的DNA甲基化模式的存在也提示DNA甲基化在癌症发展进程中扮演了重要角色。您可以想象,随着对疾病的研究从基因组序列深入到DNA修饰,DNA甲基化检测可能会有更为广泛的应用前景。

DNA甲基化的金标准

为了探索DNA甲基化,研究者们已经开发了不少检测方法。相比甲基化敏感的限制内切酶解,甲基化DNA免疫共沉淀等方法,重亚硫酸盐测序始终是这一领域的金标准——因为能定性定量、且能达到单碱基分辨率地鉴别5’甲基化胞嘧啶,特别是与新一代测序技术结合后,大规模多样本、每个样本多个位点分析都可以在一个流动池里完成测序,使得重亚硫酸盐测序成为更加精确、灵敏和高效,和具有性价比的定量甲基化分析技术。

重亚硫酸盐测序首先需要进行重亚硫酸盐转化。重亚硫酸盐处理会将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,这些尿嘧啶会在随后的PCR扩增中变成胸腺嘧啶。甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。这一步骤能使平时检测不到的表观遗传学信息,转变成为容易检出的序列信息,分辨率达到单个碱基。

重亚硫酸盐转化的关键

当然,重亚硫酸盐测序也有自己的软肋。重亚硫酸盐转化需要严苛的化学条件(低pH、高温、高摩尔浓度的重亚硫酸盐长时间处理)才能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而这种条件会导致DNA降解,降解水平可高达到90%而无法进行后继实验。但不那么严苛的化学条件则可能导致未甲基化的胞嘧啶转化不充分,让我们对甲基化水平产生过高的估计。我们需要慢慢摸索条件,合理调整参数,才能在转化效率、DNA降解和转化特异性这三个决定重亚硫酸盐转化的关键参数上达到一个最佳的平衡。这当然不是一件容易的事儿。

好在,各大公司纷纷推出了经过优化的重亚硫酸盐转化试剂盒。如果你不想把时间浪费在漫长的摸索中,商业化试剂盒的确是理想的选择。这些试剂盒经过专业团队的精心打磨,在性上都有一定的保证。那么,几种重亚硫酸盐转化试剂盒在实战中的表现谁更强呢?为了选出后继实验采用的试剂盒,塞浦路斯一个研究团队开展了一场华山论剑式的试剂盒比较,并将PK结果发表在PLoS One杂志上。生物通在此介绍一下比赛结果,给大家参考一下。

重亚硫酸盐转化试剂盒大比拼

塞浦路斯神经和遗传学研究所的科学家们对市面上四种常见的重亚硫酸盐转化试剂盒进行了比较,包括Diagenode公司的Premium Bisulfite kit、Qiagen公司的EpiTect Bisulfite kit、Promega公司的MethylEdge Bisulfite Conversion System以及Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification kit。他们分析了这些试剂盒的转化效率、DNA降解情况和转化特异性,并将比较结果发表在PLoS One杂志上。

实验设计

简单地说,将PCR扩增的2个λDNA片段产物各分为两份,由于PCR会抹掉模板上甲基化基团,其中一份产物就作为完全未甲基化的对照,另一份以SssI甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)充分处理后,并经过CpG甲基化敏感的限制性内切酶HpyCH4IV酶切评估甲基化程度,作为人工完全甲基化样本的对照。然后按照不同比例将它们混合在一起,制成甲基化水平不同的DNA样本。他们用四种试剂盒对这些DNA样本进行重亚硫酸盐转化(每种条件均设3个平行技术重复),然后以转化后的序列为模板设计的重亚硫酸盐特异引物(特别设计为不含CpGs以便能结合甲基化和未甲基化序列)进行扩增,分别通过Sanger测序和新一代测序,电泳和荧光核酸定量仪来评估结果,分别就转化效率,DNA降解,转化特异性三大方面进行比较。

选出他们认为最适合的试剂盒后,研究人员还模拟孕妇血液中循环游离DNA,用一位未怀孕妇女的全血样品以一系列梯度加入绒毛膜样本来源的DNA(从50%到3%),组成不同甲基化程度的人类基因组样本,用选定的试剂盒检测了研究人员早前发表的2个差异甲基化区域(DMRs)的甲基化情况,检测分辨率达到单个碱基(每种条件均设3个平行重复)。

转化效率

作为质控步骤,重亚硫酸盐转化的DNA用非重亚硫酸盐转化特异的Primer开展PCR以扩增未转化的产物,可初步评估转化效率。例如,对DMRs,用未转化序列互补的引物扩增,没有扩增产物表示完全DNA转化。

为了更准确评估转化效率,PCR扩增子分别用Sanger和Illuminar Miseq进行测序。由于只有非甲基化的胞嘧啶(C)在作为重亚硫酸盐转化过程中被转化为尿嘧啶,因而只能用非CpG甲基化的胞嘧啶来评估转化效率。

Sanger测序结果表明4个试剂盒均显示100%转化率?原来,Sanger测序对一个特定位点能检出2种碱基的前提是低丰度样本占比要超过15%,在这样的高手巅峰对决中,少量不完全转化就检测不出来了!最后只能通过高科技的Miseq,用BSMAP软件才能决出胜负:该软件以全部C为参考序列,执行不对称的C/T分析,在转化的模板所读取的T可被考虑为C/T、但反之不行。BSMAP能够支持多重CpG杂合甲基化模式检测,也支持非CpG位点的C甲基化检测。综合考虑多个因素,最后Promega公司的MethylEdge Bisulfite Conversion System转化效率最高,为99.8%。Diagenode公司的Premium Bisulfite kit转化效率为99%,Qiagen公司的EpiTect Bisulfite kit转化效率为98.4%,Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification kit转化效率为97.9%。犹如100米短跑高手对决,差别其实就那么几毫秒。

DNA产量和降解

前面说过,重亚硫酸盐处理不彻底会导致不完全转化,从而最终错误评估甲基化水平;但是严苛的脱嘌呤反应条件之下,DNA的降解使得DNA模板数量大为下降,产物可谓一地鸡毛—— 一堆被降解为片段的、兼具DNA和RNA特征的单链混合物,有时候会严重得以至于无法进行后继PCR扩增,或者扩增产物存在各种可变性而难以定量。所以重亚硫酸盐处理后评估DNA回收率是非常重要的一步。

为了评估DNA降解情况,研究人员定量分析了这些试剂盒的DNA产量。这个简单,只要将转化后的产量和转化前进行比较就行了,每个数据以Sanger测序的4个不同浓度x 3个平行对照的12份样本取平均。数据表明,Diagenode公司的Premium Bisulfite kit获得了最高的DNA产量(55% ± 2.6%),其次是Promega公司的MethylEdge Bisulfite Conversion System(52% ± 3%)和Qiagen公司的EpiTect Bisulfite kit(50.2% ± 2%)。Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification kit产量最低,只有33.2% ± 3.4%,但还是完全足以进行后继的PCR反应。这回比试,一个高手被抛离第一方阵了!

转化特异性

重亚硫酸盐转化是期望将未甲基化的C转化为T,甲基化的C保持不变。因此,如果甲基化的C也错误的转化为T就会导致错误的低估甲基化水平,这种情况应该尽可能避免。通过将已知量的人工甲基化DNA混入完全未甲基化的DNA样本,用不同试剂盒进行重亚硫酸盐转化,然后通过测序评估样本的甲基化水平,计算测定值与实际甲基化水平之间的相关系数。实测值与预期值非常接近,也说明了这种方法定量CpG甲基化的准确性和稳定性。Diagenode公司的Premium Bisulfite kit和Promega公司的MethylEdge Bisulfite Conversion System在初步评估中获得了更高的相关系数,说明它们实现了更为准确的重亚硫酸盐转化。研究人员在Illumina测序平台上进一步分析了这两个试剂盒。研究显示,Promega试剂盒和Diagenode试剂盒的转化特异性都很好,性能差异比较小(相关系数分别达到0.99和0.97)。由此Promega公司的试剂盒再次取胜。

最后表现非常接近的Promega和Diagenode试剂盒在MiSeq平台上对多个不同甲基化程度的样品分析结果再进行比较,Promega最终以微弱优势胜出。

根据文章的结果综合考虑的话,性能最好的是Promega公司的MethylEdge Bisulfite Conversion System,其次是Diagenode公司的Premium Bisulfite kit。他们最终选择用Promega公司的试剂盒研究全血的绒毛膜样本,分析自己感兴趣的甲基化差异区域(DMR)。(MethylEdge Bisulfite Conversion System产品链接:http://cn.promega.com/products/epigenetics/methylation-analysis/methyledge-bisulfite-conversion-system/

塞浦路斯的这个研究团队在2009年发表了第一个大规模DMR鉴别分析,鉴定出2000多个在妇女全血中与胎盘DNA之间存在差异甲基化的区域。发现这类标志物对于无创产前诊断非常关键,因为这提供了能正确区分胎儿和母体DNA的工具。在2011年他们就成功利用21号染色体上的一组DMRs,用甲基化免疫共沉淀+qPCR方法检测出21三体。因此,在本次研究中,他们首次用NGS在单碱基分辨率的基础上分析了其中(21号染色体)两个DMRs,EP6和EP10,这两个区域在绒毛膜样本CVS中呈现高度甲基化而在正常妇女全血中呈低度甲基化。

按比例混合全血和绒毛膜样本,研究人员再次在Sanger和MiSeq平台上用选定的MethylEdge Bisulfite Conversion System对他们早前发表的两个DMRs(EP6和EP10)进行单碱基分辨率的分析。结果表明EP10的所有CpG位点在绒毛膜样本(CVS)中的甲基化程度(>75%)远远高于全血样本(<10%),而EP6在部分位点甲基化程度高(80%)部分中等(50-60%)还有两个位点甲基化程度低(35-40%)。研究人员还简单探讨了在甲基化样品低于3%时结果可能存在偏向性,以及引物导致的偏向性。

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这场华山论剑,额,塞浦路斯论剑,主要侧重在转化效率、DNA降解和转化特异性三个方面评估,Promega的MethylEdge Bisulfite Conversion System成绩彪炳,考虑到他家一向物美价廉的口碑,应该会是当之无愧的性价比之选。还有一些参数没有进行比较,比如DNA的纯度和稳定性,操作难易程度,时间等,当然还有价格。由于此前有研究表明重亚硫酸盐转化后的潜在污染并不影响后继的PCR实验,纯度方面的问题没有在考虑之内。研究团队则表示他们将进一步降低降低启始DNA量,以接近血浆中的量,最终实现用血浆代替全血检测。

表观遗传学尤其是DNA甲基化研究是生命科学领域的一大热潮。重亚硫酸盐测序是分析DNA甲基化的基础工具,也是甲基化研究中最受欢迎的技术。重亚硫酸盐转化联手NGS测序则可以实现高通量、高周转速度地以单碱基分辨率来进行跨越基因组范围的甲基化分析。不过,没有哪一种技术是十全十美的,只有了解它的人才能够驾驭它。如果说重亚硫酸盐测序是一匹烈马,那么商业化试剂盒就是已经驯服的良驹,它会使你的表观遗传学之旅更加顺利。

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:Bisulfite Conversion of DNA: Performance Comparison of Different Kits and Methylation Quantitation of Epigenetic Biomarkers that Have the Potential to Be Used in Non-Invasive Prenatal Testing

(http://www.ebiotrade.com/)
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