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2016版干细胞培养工具盘点

【字体: 时间:2016年07月07日 来源:生物通

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  如今,干细胞研究不再是“高大上”的代名词,随着更多试剂和工具的出现,它已慢慢普及。研究人员能够让分化的细胞回到多能状态,让诱导多能干细胞(iPSC)与胚胎干细胞几乎没有区别,让这些细胞几乎永远生长。那么,我们来看看研究人员是如何维持多能干细胞的。

出于各种各样的目的,研究人员培养和使用多能干细胞(PSC)。也许他们想了解多能干细胞的基础生物学,也许他们希望获得分化的细胞、组织和器官。由于干细胞可来源于不同的群体,它们在疾病治疗和药物开发上拥有巨大潜力。

国际干细胞研究协会(ISSCR)的主席、霍华德休斯医学研究所的Sean J. Morrison表示:“细胞免疫治疗和改造T细胞(CAR T细胞)的进展让人激动不已,这是开创性的研究,将带来更好的基因和细胞治疗。”

如今,干细胞研究不再是“高大上”的代名词,随着更多试剂和工具的出现,它已慢慢普及。研究人员能够让分化的细胞回到多能状态,让诱导多能干细胞(iPSC)与胚胎干细胞几乎没有区别,让这些细胞几乎永远生长。那么,我们来看看研究人员是如何维持多能干细胞的。

滋养层

多能干细胞不喜欢单独待在不太熟悉的地方,换句话说,它们需要一些家的感觉。许多研究人员使用小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞,以支持PSC克隆的生长。不过MEF分泌不确定的异源蛋白及其他物质,使得一些研究人员不得不去寻找替代品,比如人源的胚胎和成体细胞。尽管这些并非异源的,但它们也可能将不确定的因素引入培养。

对多能干细胞而言,最常用的基质也许是Matrigel,这种基底膜提取物来自小鼠肉瘤,由Corning生产和销售,但其他供应商也提供类似产品。不过据奥克兰大学生物科学的助理教授Luis Villa-Diaz介绍,与MEF类似,Matrigel也是一种异源产物,并非完全限定的,存在批次之间的差异。“它表现不错,但有一些变化。”

一些研究人员则以重组蛋白作为他们的基质:“层粘连蛋白和纤维连接蛋白似乎在人类干细胞研究中最受欢迎,玻璃粘连蛋白也挺受欢迎,”Biological Industries的技术培训经理Lia Kent指出。特定亚型(如层粘连蛋白-521)或片段经常被使用。

合成的基质也被使用。例如,Corning提供了培养瓶、多孔板和微载体,其上包被了Synthemax以及浓缩的Synthemax II-SC基质。据介绍,这种易于使用的材料创建了一个独特的合成表面,模拟了天然的细胞环境。

了解赛默飞世尔的多能干细胞培养工具


培养基

有些干细胞培养使用血清,它们含有多种成分,其中一些是未知的。有些则使用更限定(但不完全限定)的血清替代物,通常含有血清白蛋白及其他动物来源的产物。这些可从多家供应商处购得,比如GIBCO™ KnockOut™ Serum(由赛默飞世尔提供)。

血清“有能力维持细胞生长,但同时也有可能诱导它们分化,因此这里有一个平衡,”Villa-Diaz解释道。他将这个比喻成在浑水中钓鱼,根本不知道往哪儿下钩子。“如果你有无异源成分、化学成分限定的条件,那么你清楚知道培养基和基质中的所有组分,这就好比在清水中钓鱼。无论你采用哪种处理,你都知道哪些变量会受到影响。”

在这一方面,威斯康星大学的James Thomson起了很大的推动作用。他的实验室报告了一种名为TeSR的配方,在完全没有异源蛋白的情况下支持PSC的生长。不过“人血清白蛋白和人源基质蛋白的加入让这些条件的成本过高,不利于常规使用,也不是真正的完全限定,”他的研究小组这样描述TeSR。如今这个配方经过一些修改,已经商业化,它就是Essential 8培养基(E8)。

Thomson的研究小组采用一种艰难的组合方式来创建E8培养基,将TeSR的18种成分缩减到8种,在加入DMEM/F12基础培养基之后,可与TeSR一样支持干细胞的生长。“一个主要的改进是省去了血清白蛋白成分,因为无论是动物还是人源的白蛋白都存在批间差,这一直困扰着人类ES和iPS细胞培养,”他们写道。

培养方式

与小鼠干细胞不同,不与其他细胞接触的人类多能干细胞将很快开始经历失巢凋亡(anoikis),这是程序性细胞死亡的一种形式。这不仅在传代和培养细胞时出现,也在冷冻、解冻和分选细胞时出现。因此,细胞通常以团块形式传代,或用抗凋亡剂处理,如Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。

不过,NIH干细胞部门的研究人员Kevin Chen指出,ROCK抑制剂是强效的药物,可能对培养有一些副作用,长期影响尚未经过评估。Chen及其同事正在研究其他的方法,包括采用各种基质来模拟与邻近细胞的接触,希望能绕过ROCK抑制剂。Chen不倾向于培养细胞群落,而是支持非群落的单层培养。他觉得这样更容易操作,产量也更高。

人们也有意采取悬浮培养的方式扩大PSC的培养。为此,STEMCELL Technologies很快将推出mTeSR3D,这经过改造和优化,适合补料分批操作。据介绍,从6孔板开始,这种培养基可在两周内使细胞个数达到109

如今,越来越多的工具可用于多能干细胞的培养,从解离和冻存试剂到多能性标志物的检测试剂盒。同时,科研、临床和制药实验室也在不断开发新的操作,希望能快速推动这个领域的发展。

(作者:Josh P. Roberts、Peter A. Fung | 生物通编译)

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