人机大战:NGS文库构建和序列捕获大比拼

【字体: 时间:2016年08月02日 来源:伯齐科技

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  在NGS过程中,构建基因文库是整个测序进程中第一个步骤,也是最为关键步骤,基因文库的质量直接影响后续的测序工作。虽然二代测序技术发展迅速,但是基因文库的构建仍然是一项十分耗费时间以及重复性高的工作。

随着测序技术的发展,科学界也开始越来越多地应用测序技术来解决生物学问题。在过去的十年里,新一代测序技术—第二代测序(NGS)迅猛发展,越来越多的测序实验室采用NGS技术作为测序主要手段。而且NGS高通量的特点,使之成为研究DNA和RNA的主要工具。

在NGS过程中,构建基因文库是整个测序进程中第一个步骤,也是最为关键步骤,基因文库的质量直接影响后续的测序工作。虽然二代测序技术发展迅速,但是基因文库的构建仍然是一项十分耗费时间以及重复性高的工作,需要熟练的科研技术人员在整个操作过程中保持需高度注意力,花费5个小时甚至更多的时间才能完成建库工作。

为了减轻测序工作人员负担,解放双手,法国罗氏诊断公司与派玛·迪格(PrimaDiag)公司宣布合作,开发了ACSIA NGSLibPrep自动化移液工作站,为罗氏提供的建库产品提供自动化解决方案,将繁琐冗长的建库工作自动化。

派玛·迪格公司成立于法国,专注于科学和医学生物领域,针对生物学特别是分子生物学领域的各种需要的自动化操作工作,创新研制简单但强大的自动化平台。

ACSIA NGSLibPrep全自动建库系统移液精准,重复性高,在建库过程中避免了任何人为误差,从而提高文库的质量。罗氏诊断公司提供建库用的KAPA建库试剂盒在这个平台上能实现完全自动化,不需要任何人工参与。所以使用ACSIA NGSLibPrep进行建库工作是一种非常经济合算的方法。Kapa Biosystems和罗氏NimbleGen的建库操作步骤都在ACSIA NGSLibPrep自动化平台上进行了步骤优化,预设了运行程序,因此,使用ACSIA NGSLibPrep自动化平台构建基因文库,只需要打开预设的方法,输入样本数,点击OK就可以了。人工完成建库长达5小时的工作,用ACSIA平台只需要人工操作15分钟,其他的都由ACSIA平台代替完成。

ACSIA NGSLibPrep平台使用了派玛.迪格公司的创新专利技术APIM(感应磁化吸引技术),根据需求通电或断电产生磁力去极化,无需转移微孔板就可以对磁珠进行吸引和释放,实现磁珠零残留。此外,ACSIA NGSLibPrep全自动建库系统上可以配置市场上供应的任何类型的微孔板和深孔板。所有的液体参数经过精心优化,系统设有专利的SMT智能省枪头系统,可在没有交叉污染的情况下重复使用枪头。这使得建库所使用的实际试剂消耗达到最小,而优化的操作步骤也允许使用最少的枪头数来完成整个建库工作,大大节约试剂和耗材成本。在ACSIA NGSLibPrep平台上构建48个DNA文库仅需要3盒枪头,而人工操作使用的枪头数会达到14盒之多;处理每个样品平均使用的枪头数从人工完成所需要的28个降到了6个,大大节省了枪头成本。比较ACSIA和人工建立的文库质量,使用ACSIA处理样本,得到的样本浓度更加均一,变异系数小。(见图1)

除了罗氏和Kapa Biosystems试剂,派玛.廸格已先后跟多个NGS试剂厂家合作,并进行优化,包括Illumina、NEB、安捷伦等。所以,ACSIA NGSLibPrep全自动建库系统已内置各试剂厂家的优化实验程序,用户只需在平台上放好试剂,打开相对应的试剂程序,需入样本数量,系统便会全自动地把工作完成。真正轻松进行NGS实验!!

图1展示的是用KAPA建库试剂盒,使用ACSIA自动化平台和人工操作平行处理12个样本,自动化平台建库的到的样本浓度范围从22.93~27.83 ng/μL,变异系数是1.25,人工建库的到的样本浓度范围是22.52 t~ 47.73 ng/μL,变异系数是8.29。

Figure 1: Variation of concentration between 12 samples prepared on ACSIA (blue) and manually (red)

了解更多的NGS文库构建和序列捕获产品


在二代测序(NGS)过程中,构建基因文库和目的序列捕获富集是制约测序进程的瓶颈。上期我们介绍了针对于建库工作的自动化解决方案,这里我们针对靶序列捕获富集,提供自动化解决方案。

近几年来,第二代测序逐渐向提高通量和降低费用的方向发展。为了节省分析时间,找到经济合算的方法,罗氏诊断开发了SeqCapEZ捕获试剂盒,允许用户富集所感兴趣的区域或者全外显子组。但是二代测序是一项非常耗时耗力的工作,常常要耗费专业的技术人员4天的工作时间来完成。而且测序过程中的一些重要的注意事项也要求技术人员在整个操作过程中要保持高度集中精力,比如捕获目标序列,加热试剂盒样品,孵育时间的控制等。

受到这些限制,将序列捕获自动化就成为大多数实验室的需求。法国罗氏诊断公司与专业的自动化平台生产商派玛·迪格(PrimaDiag)公司合作,为罗氏NimbleGen外显子捕获测序产品提供自动化解决方案 — ACSIA NGScapture自动化捕获系统。ACSIA NGScapture系统适用于罗氏NimbleGen SeqCap Enrichment System的所有测序产品。

ACSIA NGScapture自动化捕获系统使用PrimaDiag公司的创新专利技术APIM自动处理磁珠,控制温度精准到0.1℃,震荡速度从200到3000rpm可调,在磁珠捕获和洗涤阶段,自动完成加热洗液、洗涤磁珠,孵育和震荡的操作。

ACSIA NGScapture系统使用灵活,易于操作,用户可以根据需要定义样本数。所有的液体参数都经过精心优化,使得建库所使用的实际试剂消耗达到最小,而优化的操作步骤也允许使用最少的枪头数来完成整个建库工作,大大节约试剂和耗材成本。例如使用罗氏的SeqCap EZ kit,做48个反应,ACSIA NGScapture系统只需要3盒枪头,而人工完成则需要9盒枪头之多,是自动化操作使用数量的3倍。

罗氏NimbleGen的序列捕获试剂盒已经在ACSIA NGScapture系统上进行了验证,做了步骤优化,预设了运行程序,因此,使用ACSIA NGScapture自动化平台捕获目的序列,只需要打开预设的方法,输入样本数,点击OK就可以了。

比较ACSIA和人工捕获效果,测序结果显示通过两种操作方式捕获的18个基因覆盖深度是相似的,ACSIA自动操作(蓝色)捕获的基因测序覆盖深度甚至略好与人工操作(红色)。见图2。

ACSIA NGScapture自动化捕获系统,灵活简单的操作,高质量的捕获效果,真正实现轻松完成NGS实验。

图2: Depth of coverage of 18 captured genes of samples prepared on ACSIA (blue) and manually (red)

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