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细胞无标记检测技术通关宝典 [选购宝典]

——选择最适合的检测工具,你准备好了吗?

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年8月12日 来源:普瑞麦迪

摘要:

  活细胞无标记技术是近年来发展迅猛的实验技术,目前许多前沿的细胞生物学、医学实验室、制药类公司通过这种方法研究活细胞,而不用担心荧光标记是否会造成二次影响。研究人员希望尽可能在接近生理条件下进行活细胞分析,进而无标记技术在活细胞研究方面扮演的角色愈加重要。目前无标记技术主要包含电阻抗检测、成像检测等多种检测技术。

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对于生命科学工作者来说,使用标记和标签来解析和鉴定细胞中的组分和目标是常规的研究手段。细胞标记和标签帮助研究人员更好地理解生命活动的许多重要的现象,但是这些标签标记后的细胞是否是原始的生理状态,标签是否会影响细胞结构、运动和物质组份呢?

活细胞无标记技术是近年来发展迅猛的实验技术,目前许多前沿的细胞生物学、医学实验室、制药类公司通过这种方法研究活细胞,而不用担心荧光标记是否会造成二次影响。研究人员希望尽可能在接近生理条件下进行活细胞分析,进而无标记技术在活细胞研究方面扮演的角色愈加重要。目前无标记技术主要包含电阻抗检测、成像检测等多种检测技术。

电阻抗检测

ACEA Biosciences公司通过xCELLigence实时细胞分析(RTCA)技术来提供无标记分析,它检测电阻抗,以评估细胞与培养板的粘附程度。电极整合在一次性的E-Plate微孔板底部,实时检测电阻抗。因此,细胞数量、粘附和形态的变化都可以检测到。这种技术广泛应用在多个领域。

例如,xCELLigence RTCA Cardio系统就可以监控心肌细胞的自发跳动,用在心脏不稳定药物的治疗过程中。他们第二代的CardioECR系统还包含场电位电极,可监控电活动,并提供刺激性的起搏功能。据ACEA Biosciences全球产品经理Leyna Zhao介绍,研究人员可研究心脏病患者的细胞,查看心肌细胞的形态、跳动功能和电活动,这样就能筛掉对心肌细胞有不良影响的化合物。

随着越来越多的癌症药物以抗体或免疫细胞疗法的形式出现,研究人员也在寻找一种分析,以检测抗体或免疫细胞的功效。ACEA Biosciences的技术也提供了一种自动化的均质筛选平台,可捕获免疫细胞杀死特定癌细胞的动力学。“研究人员希望有一种分析能预测改造后的T细胞,如CAR-T细胞,是否在癌细胞上有良好的功效”。当免疫细胞加入附着在电极板上的肿瘤细胞时,这种分析利用电阻抗来测定细胞死亡。由于免疫细胞不附着,它们不会对电阻抗产生影响。

然而电阻抗方面的局限性是无法“看到”细胞,一些细胞重要的形态、结构、甚至细胞内部的变化无法通过此种方法得到数据。而且对于悬浮细胞、甚至特殊的贴壁细胞电阻抗方法检测也无法实现。

成像技术

基于细胞成像的分析技术一般需要使用荧光染料进行标记或细胞进行固定,一些荧光标记可能对活细胞具有毒性。无标记细胞分析技术使得研究者既无需耗时耗力的染色流程也无需担心染料对正常细胞活力的影响,就可以计算出细胞数目、细胞汇合度、细胞厚度、细胞体积等形态与结构的量化分析。目前某些高端的成像技术甚至可以对活细胞进行全场相位定量,这种非侵入性的工具,无需染料或标记,即可对细胞查看细胞的细胞核、溶酶体、高尔基体等亚细胞结构、甚至细胞骨架进行量化研究。

目前,比较常见的主要有以下三类定量无标记成像技术:

1、通用型定量相位成像技术

Phasics提供了一种新的光学显微镜观察活细胞的定量相位成像技术,无需任何标记即可对细胞的演化运行精确的统计分析(包括细胞迁移、生长、胞内过程…)。这个简单的即插即用相机模块SID4bio(C-mount连接显微镜),依靠四波横向剪切干涉专利技术,可直接检测透过任何生物样品的透射光的相位信息。SID4bio对普通显微镜升级后可极大增强镜头强捕获样本相位的能力,使半透明样本如细胞、组织有极高的对比度。更重要的是Phasics的图像亦可与荧光通道无缝匹配,例如下面用于溶酶体定位和测定特异相位特征的案例。

       

                线粒体GFP标记荧光成像                                   Phasics相位图像

研究使用了野生型的COS-7细胞系。SID4bio模块插入传统明场显微镜,配备了卤素光源。使用近红外滤镜对光源过滤,以使通过的相位光和荧光能有效耦合。SID4bio是消色差的,可与任何波长滤光片适配且不会产生额外的荧光误差,两张光学图像可同时获取。最终的耦合图像的统计分析表明,溶酶体的相对折射率相比其他囊泡是不同的,Phasics的定量相位图像可有效区分溶酶体与其他囊泡差异。

     

耦合相位与荧光图像,溶酶体为红色(RFP标记),其他囊泡为灰色。   
溶酶体的相对折射率指数(RSI)不同于囊泡。

此外Phasics创新应用还涉及到细胞有丝分裂中细胞干物质量的测定。首先,测定单个细胞在有丝分裂不同时期的干物质质量,其次是通过分析群体细胞以确定有丝分裂的比例。研究早已证明细胞的相位特征与干物质重量称正相关,通过测定细胞表面的相位参数,Phasics可获得细胞的细胞的干物质质量。此外,由于使用普通的光源照明,因此可用塑料材质的培养皿或孵育器直接成像或进行延时成像,由于细胞无需标记,细胞的各项生理特性完全是生理状态下最真实的,Phasics非常适合细胞的动态研究。

如下研究同样使用了野生型的COS-7细胞系。Phasics是领域内全新的技术,可以同时测量了大量的细胞。首先通过秋水仙素将细胞阻挡各个分裂期。通过细胞分割,对细胞干物质量和相关表面做细胞群体统计分析,进而建立一个判定细胞的分裂状态客观数值的标准。该标准将用于分割的COS-7细胞以确定细胞的有丝分裂统计值。不同的细胞系有不同的标准,例如COS-7细胞,HeLa细胞和RPE细胞等。通过设置对照细胞,可精确的得到目标细胞组精确统计数据。

   

通过在两个细胞周期测定单个野生型COS-7细胞干物质生长率变化(32小时的延时成像)
-40×物镜,细胞分割
在一个细胞周期内COS 7细胞表面与干物质量的统计分析

除了以上两个经典应用外,Phasics的相位定量技术还广泛应用于细胞形态(表面,细胞核大小)、细胞跟踪(运动性、增殖)、细胞监控(单个细胞的生长率、存活、分化,细胞发生凋亡)、细胞光学密度(分布,峰值,剖面)、快速无标记组织成像等方面,无需特殊样本制备、无需特殊细胞培养耗材、无需购买额外的成像设备,只需在原有显微镜上简单升级,可以说Phasics是目前最“平易近人”的无标记活细胞成像技术。但Phasics存在一些无法克服的问题。

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