糖组学研究，我们有啥新工具[新品推荐]

大家都知道，贝类的特征是有一个坚硬的壳。壳的形成本身是大自然的一个奇迹，因为动物将有机大分子和矿物质转化成坚硬的保护结构。

壳究竟如何形成，我们无从知晓。不过，新罕布什尔大学UNH糖组学中心的主任Vernon Reinhold表示，关键在于糖。软体动物的内壳表面和动物外部之间存在着一个小口袋的液体，称为extrapillial fluid。这些液体驱动了壳的形成。它的主要成分是一种被称为EPG的钙结合蛋白，这个同源二聚体的表面至少有三个复杂的多糖。

从这方面来看，EPG并非异类。据哈佛医学院糖科学中心的主任Richard Cummings介绍，许多细胞内的蛋白，以及大多数细胞表面和分泌蛋白，都经过糖基化的修饰，这个过程改变了蛋白在许多生物进程中的功能。“移植、输血、心血管生物学、传染病、血管生成、炎症等 – 多糖在所有这些生物学通路和疾病中起作用，”Cummings说。

为了了解这些过程，“我们必须了解多糖的结构和功能之间的关系，”Cummings说。然而，我们目前知道的还太少。在某种程度上，这是因为多糖就像特别坚硬的坚果。与蛋白和核酸不同，多糖不是通过模板构建的，而是由细胞表达的酶决定的。

糖链可以是直链或支链，有多个可能的连接，并且每个糖单体都可以进行化学修饰。任何蛋白都可以支持多个可能的多糖结构。“我们将其称之为糖组（glycome），也就是人体或动物体内所有多糖的集合，这种复杂性是巨大的，未知的，”Cummings说。不过，简化糖组分析的工具正在慢慢显现。

质谱

糖组学研究的一个重要工具是质谱。研究人员利用质谱将复杂的多糖结构分解成组成部分，就像蛋白质组学一样。不过，对糖类而言，这个过程更加复杂。一方面，许多糖单体是结构异构体，这意味着它们有着相同的质量，因此在质谱仪上有着相同的表现。另外，多糖可以用多种方式连接，因此仅仅知道顺序是不够的。

对Reinhold而言，答案就是离子阱质谱，这种仪器让研究人员能够开展所谓的MS(n)实验，其中离子被反复称量、片段化和重新分析，以确定它们的精确结构。“知道多糖散架时采用哪条方式，我们就能向后推断，将它们重新拼起来，”Reinhold解释道。

在过去十年，Reinhold和他的团队利用这种策略，解析了EPG多糖的精确化学结构1。他说，这些信息有望帮助人们深入了解其他的生物矿化过程，包括骨沉积。

赛默飞世尔的资深糖组学专家Julian Saba建议研究人员选择高分辨率的质谱仪，比如基于Tribrid Orbitrap的Fusion和Lumos质谱仪。“就性能而言，这是一个飞跃，”Saba说。仪器采用tribrid技术，让你能够尽可能将多糖离子化，并通过质谱仪来分析。仪器具有多种解离模式，包括碰撞诱导解离（CID）、高能量碰撞解离（HCD）、电子转移解离（ETD）以及新的组合解离方式EthcD，让研究人员能够鉴定与肽段/蛋白连接的多糖。Saba建议在肽段测序时使用ETD或EthcD，以确定糖基化位点，而在了解多糖组成时使用HCD或CID。

对于那些希望更深入了解多糖信息的研究人员，Saba建议他们从肽段/蛋白上释放多糖，并单独进行分析。如果需要比较不同时间或不同条件下的多糖图谱，Saba建议使用赛默飞的aminoxyTMT试剂，这种羰基反应性的试剂是专为标记多糖而设计的。有了这些试剂，研究人员在单次运行中最多可组合6个样品。

了解赛默飞世尔适用于糖组分析的质谱仪

鸟枪法

市场上也有一些适合糖组学的试剂。RayBiotech等公司提供多糖芯片。Vector Laboratories提供一系列凝集素（碳水化合物结合分子），而法国公司Elicityl出售纯化的多糖结构。

New England Biolabs等公司提供肽N-糖苷酶F（PNGase F），这种酶从蛋白支架上切割大多数N-连接糖蛋白。目前还没有相对应的O-连接糖蛋白试剂，它们必须通过化学方法释放。

Cummings最近报道了一种基于家用漂白剂（次氯酸钠）的方法2，它可以在几分钟之内从动物或植物的组织中释放N-和O-连接多糖。他将这种策略称为“鸟枪法糖组学”，也就是从组织中释放多糖，将其纯化，上柱分离，印在芯片上，然后拷问。他认为，利用这种策略可筛选出每个人独特的碳水化合物抗体特征，这些信息也许能解释人们的疾病易感性差异。

第二篇发表于2015年，它介绍了一种名为CORA的神奇方法，有点像PCR，能扩增活细胞中的O-多糖。根据已发表的结果3，这个过程利用经过修饰的糖来起始多糖的生物合成，让O-多糖的检测灵敏度提高1000倍。

Cummings认为，鸟枪法糖组学为了解人类糖组提供了一种方式，而无需化学合成。多糖的化学合成是十分困难的，他解释道。不过，糖组研究也同样存在先有鸡还是先有蛋的问题。“你都不知道人类糖组是什么，你怎么合成。”’

（作者：Jeffrey M. Perkel / 生物通编译）

参考文献

[1] Zhou, H, et al., “Anomalous N‐glycan structures with an internal fucose branched to GlcA and GlcN residues isolated from a mollusk shell-forming fluid,” J Proteome Res, 12:4547-55, 2013. [PMID: 23919883]

[2] Song, X, et al., “Oxidative release of natural glycans for functional glycomics,” Nat Methods, doi:10.1038/nmeth.3861, published online May 2, 2016. [PMID: 27135973]

[3] Kudelka, MR, et al., “Cellular O-glycome reporter/amplification to explore O-glycans of living cells,” Nat Methods, doi:10.1038/nmeth.3675, published online November 30, 2015. [PMID: 26619014]