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如何利用CRISPR实现单碱基编辑[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年8月31日 来源:生物通

摘要:

  哈佛大学David Liu的实验室创建了新的Cas9融合蛋白,可作为“单碱基编辑器”。这些融合蛋白包含dCas9或Cas9切口酶以及大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1,它能将胞嘧啶转化为尿嘧啶,而无需切割DNA。之后,通过DNA复制或修复,尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶。这种碱基编辑策略有望治疗数百种遗传病。

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当我们谈论CRISPR的应用时,有一点是绕不过去的:同源定向修复(HDR)的编辑效率低。与非同源末端连接的随机过程相比,HDR总是以相当低的频率发生,并且在非分裂细胞中,这种通路被进一步下调。同时,HDR的编辑总有一些脱靶效应,即使gRNA被精心设计。

为此,哈佛大学David Liu的实验室创建了新的Cas9融合蛋白,可作为“单碱基编辑器”。这些融合蛋白包含dCas9或Cas9切口酶以及大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1,它能将胞嘧啶转化为尿嘧啶,而无需切割DNA。之后,通过DNA复制或修复,尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶。这种碱基编辑策略有望治疗数百种遗传病。下面,我们就来看看它是如何实现的。

dCas9/切口酶碱基编辑

Liu实验室对“单碱基编辑器”的要求十分简单:

1. 将Cas9与胞苷脱氨酶融合
2. 在gRNA的指导下,Cas9到达指定位点
3. 目标胞嘧啶在非目标链的第4-8位

David Liu实验室的Komor等人最初利用APOBEC1和dCas9创建出第一代的碱基编辑器(BE1)。为了确定这种蛋白的编辑能力,他们将纯化好的碱基编辑器与DNA底物共同孵育。在脱氨基后,他们利用尿嘧啶特异的USER酶来切割脱氨基的DNA,并确定脱氨效率。BE1表现出约5个核苷酸的活性窗口,从第4到第8位。对于多个目标,体外编辑的平均效率达到44%,其中前面是T或C的胞嘧啶效率最高。考虑到只修饰一条链,最大的编辑效率只有50%,这些编辑结果令人印象深刻。

然而,当Komor等人转移到细胞培养模型,他们发现编辑效率从44%降低至0.8-7.7%,这可能是由于碱基切除修复(BER)去除了DNA中的尿嘧啶。于是,他们的第二代BE2系统就融合了这个过程的抑制剂,将编辑效率提高三倍,最高达到20%。对于BE1和BE2,由于DNA并非直接切割,插入缺失的形成非常少(< 0.1%)。

为了让碱基编辑的效率超过50%,你需要将编辑复制到另一条DNA链上。为此,Komor等人将dCas9变身为切口酶,以便模拟错配修复。BE3在未修饰的DNA链上产生切口,这样它看起来像是新合成的。因此,细胞以含有尿嘧啶的链作为模板修复DNA,并复制碱基编辑。

BE3系统将各种目标的编辑效率提高到30%以上。这与Cas9介导的HDR相比是巨大的进步,因为HDR介导的编辑效率仅为0.5%。在细胞多次分裂后,CRISPR碱基编辑仍然存在,表明这种方法产生了稳定的编辑。Komor等人利用HDR和BE3来编辑APOE4和p53中的致病突变。Cas9介导的HDR效率非常低(0.1-0.3%)或检测不到,而碱基编辑效率的范围在58-75%(APOE4)至3-8%(p53)。

Komor等人还检查了碱基编辑器是否诱导脱靶突变。利用之前鉴定的gRNA,他们分析了每条gRNA的10条已知脱靶序列,并在一些脱靶序列中发现了胞嘧啶转换。不出所料,野生型Cas9诱导了最多的脱靶突变。好消息是,gRNA序列周围的胞嘧啶似乎没有受到脱靶编辑,表明脱靶编辑来自Cas9,而不是APOBEC1。未来,利用高保真Cas9开发的碱基编辑器也许能改善这一问题。

基因编辑技术的比较

 

HDR

BE1

BE2

BE3

Cas9

WT或切口酶

dCas9

dCas9

切口酶

突变位点

PAM上游的~10-100 bp

目标序列第4-8位中的C

目标序列第4-8位中的C

目标序列第4-8位中的C

gRNA

单个

单个

单个

单个

修复模板

ssDNAdsDNA

编辑类型

插入、缺失、点突变

点突变(C->TG->A

点突变(C->TG->A

点突变(C->TG->A

目标位点的NHEJ频率

目标位点的插入缺失可能比HDR修复更普遍

几乎为零

几乎为零

HDR

脱靶类型

插入缺失

其他胞嘧啶的转换

其他胞嘧啶的转换

其他胞嘧啶的转换

碱基编辑的未来

Komor等人的工作是激动人心的,因为它不再需要DNA切割和修复。为了让碱基编辑进入黄金时代,必须解决一些问题。首先,最明显的问题是酶,人们不仅仅需要C->T或G->A的酶。根据NCBI ClinVar数据库,Komor等人预计有900多种临床相关的变异就位于NGG-PAM附近,可利用第一代的编辑器来编辑。然而,这些SNP仅仅是致病变异中的一小部分,更多的变异需要用其他碱基编辑技术来靶定。

第二个潜在的问题是编辑窗口小。为了达到最佳的编辑效果,目标碱基应该在第4-8位。由于PAM的要求限制了可靶定序列的数量,利用其他的Cas9酶也许能扩展编辑范围。其他CRISPR酶,如Cpf1,在改造后也可用于碱基碱基。更多的gRNA选择也有助于提高碱基编辑的频率。这对于临床应用是特别重要的。

碱基编辑是CRISPR领域的最新成果,不过要记住,这个进步是建立在以前的工作上的。Cas9的结构和功能注释让研究人员有底气去改造Cas9,正如之前人们开发高保真Cas9。新的dCas9融合体正如雨后春笋般冒出,综合了CRISPR的好处和许多新的应用。(生物通 余亮)

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原文检索

Komor, Alexis C., Yongjoo B. Kim, Michael S. Packer, John A. Zuris & David R. Liu. “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.” Nature (2016) 533, 420–424.

(http://www.ebiotrade.com/)
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